粟雨芯，李方琳，田晓静，乔自林，李 倬，马忠仁*

（1.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

牦牛乳又称“天然浓缩乳”，富含脂肪、必需矿物质和健康的多不饱和脂肪酸，如共轭亚油酸和Omega-3脂肪酸[1]，在牧民的日常饮食中占有重要地位。目前牦牛奶对基因工程菌的增殖影响还没有研究。大肠杆菌是人和动物肠道中的常见菌群，帮助宿主消化摄入的碳水化合物等食物，其在肠道中丰度的高低会影响宿主健康。研究表明，肠道菌群与宿主健康有密切关系，如在营养吸收、病原体防御等方面[2-3]。肠道微生物菌群的变化和失调与全体性炎症和代谢综合征密切相关[4-5]。如肥胖患者肠道微生态失衡严重，主要表现为微生物多样性下降，结构偏差，拟杆菌门与厚壁菌门比例低[6]。大肠杆菌BL21和DH5α是实验室最常用的基因工程菌，具有迅速繁殖、生长、大规模培养的特点。因此，本试验以牦牛乳为研究对象，研究其对实验室常用大肠杆菌在体外培养条件下生长的影响，为进一步研究牦牛乳对人体肠道微生态的影响提供前期数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1材料与试剂 牦牛奶：采自甘肃省甘南藏族自治州玛曲县欧拉秀玛乡某农户，经八层纱布过滤后运往实验室，冻干成块状后4 ℃保存备用。

菌株：大肠杆菌DH5α和BL21及pcDNA3.1(+)质粒，西北民族大学生物医学研究中心实验室保存。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸出粉5 g/L、NaCl 10 g/L。LB固体培养基需加入2.0%琼脂粉。氨苄青霉素（100 μg/ml）。

1.1.2主要仪器设备YXQ-LS-100A立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），酶标仪（Thermo Scientific），SW-CJ-1CU超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），pH计（上海三信），ZYW-2102C恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1牦牛乳稀释液制备 称取制备的冻干奶粉溶于纯水中，配得25 mg/ml浓度的奶液，用0.22 μm滤膜过滤后，保存于4 ℃冰箱备用。

1.2.2重组大肠杆菌构建和感受态的培养 分别取1 μl pcDNA3.1(+)质粒转化至100 μl E.coli DH5α和BL21感受态细胞，冰上静置30 min，42 ℃水浴90 s后冰上静置5 min，加入900 μl LB液体培养基于37 ℃下，220 r/min摇床复苏1 h，取100 μl菌液涂布于含抗生素的LB固体培养基，本研究中抗生素仅用氨苄青霉素，与培养基的添加比例为1∶1000。37 ℃恒温箱倒置培养16 h挑取转化子接种于含4 ml LB培养基的试管中，37 ℃、220 r/min振荡培养12 h，获得氨苄青霉素抗性BL21和氨苄青霉素抗性DH5α新鲜菌液。在100 μl E.coli DH5α和BL21感受态细胞中，分别加入900 μl LB液体培养基，37 ℃、220 r/min摇床活化12 h，获得无抗BL21和无抗DH5α新鲜菌液。

1.2.3体外菌液培养试验 菌液分组培养。对照组：试管中加入9.8 ml LB液体培养基，再接种200 μl活化好的新鲜菌液。实验组：分为牦牛奶添加终浓度为5 mg/ml和0.5 mg/ml两组。5 mg/ml组中添加7.8 ml LB液体培养基，再添加25 mg/ml浓度的牦牛奶2 ml，接种200 μl活化好的新鲜菌液；0.5 mg/ml组中添加7.8 ml LB液体培养基，再添加2.5 mg/ml浓度的牦牛奶2 ml，接种200 μl活化好的新鲜菌液。其中接种氨苄青霉素抗性BL21和氨苄青霉素抗性DH5α两组菌液使用的LB培养基添加抗生素。在37 ℃、220 r/min下培养20 h，从0 h起，每隔2小时测定OD600 nm值，第20小时测定pH值。

1.2.4统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理，不同组间比较采用Kruskal-Wallis test检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 添加牦牛奶促使大肠杆菌BL21和DH5α在LB培养基中增殖

在L B基础培养基中添加不同浓度的牦牛奶，可为细菌提供营养成分。分别选择4种不同的大肠杆菌，氨苄青霉素抗性BL21、无抗BL21，氨苄青霉素抗性DH5α、无抗DH5α接种到LB培养基中培养。第18 h的试管外观照片显示5 mg/ml组的菌液较其他两组浑浊（图1），说明5 mg/ml组的大肠杆菌生长量明显增多。OD值结果也表明，添加5 mg/ml的牦牛奶对四种大肠杆菌在一定时间后相比于对照组均有明显的促进作用（图2～图5）。在对照组进入平台期后，由于培养基中营养物质的消耗，大肠杆菌繁殖速度逐渐减慢，细菌生长率等于死亡数，不再增长，而5 mg/ml组的大肠杆菌均继续增殖，有可能是由于牦牛奶中含有大肠杆菌生长代谢的营养物质。

图1 18 h四种大肠杆菌在LB培养基中增殖的外观照片

图2 氨苄青霉素抗性BL21在LB培养基中的增殖情况

图3 氨苄青霉素抗性DH5α在LB培养基中的增殖情况

图4 无抗BL21在LB培养基中的增殖情况

图5 无抗DH5α在LB培养基中的增殖情况

2.2 添加5 mg/ml牦牛奶使菌液pH值降低

在培养的第20 h，用pH计测量培养液的pH值。结果表明，添加5 mg/ml牦牛奶使四组大肠杆菌的pH值均有所下降，无抗BL21和无抗DH5α两组有显著性差异（图6）。可能是因为牦牛奶中的糖类物质在大肠杆菌的代谢中产生了有机酸，从而引起培养液pH值下降。Stewart等[7]研究发现，随着菌液密度的增加，培养基pH值逐渐下降，而降低原因是细菌代谢多糖后产生乳酸和短链脂肪酸。

图6 第20 h四组大肠杆菌的pH值比较

3 讨论

大肠杆菌是条件性致病菌，也称机会致病菌，当机体抵抗力强时，与宿主互利共生，机体免疫力降低时，则引起感染或致病。大肠杆菌因遗传背景清楚、载体受体系统完备、生长迅速、培养简单、重组子稳定等优点广泛应用于基因工程领域[8-9]。

本研究以牦牛奶为研究对象，探讨牦牛奶在体外培养中对不同大肠杆菌生长的影响。在LB培养基中添加牦牛奶培养大肠杆菌试验中，添加5 mg/ml的牦牛奶对氨苄青霉素抗性的BL21、DH5α和无抗性的BL21、DH5α的生长都有明显促进作用，试管照片肉眼可见的浑浊也证实了细菌明显增殖。同时pH值的降低，启示在肠道菌群中牦牛奶与有机酸的关系有必要进行深入研究。本研究证实牦牛奶对大肠杆菌BL21和DH5α在体外培养中有促进作用，提示牦牛乳的某些成分具有制成大肠杆菌培养基的潜力，但有待进一步研究。