徐梅玲 张育珠 申大年

(1青海省第五人民医院疼痛科，青海 西宁 810000；2西宁市第一人民医院疼痛科；3青海省第五人民医院泌尿科)

骨质疏松是一种常见的与年龄相关的退行性疾病，其主要特征表现为骨组织的显微结构退行性改变和骨密度降低。骨质疏松可引起骨脆性增加，骨强度降低，易发生骨折〔1〕。骨质疏松的核心发病机制是雌激素下降导致的成骨细胞骨形成能力降低和破骨细胞骨吸收增强，即骨重建和骨吸收失衡〔2〕。成骨细胞是骨形成的主要细胞，参与骨组织的代谢平衡、生长发育及损伤修复。在骨形成过程中，成骨细胞经历骨增殖、分化和凋亡3个阶段，其增殖、分化和凋亡的异常在骨质疏松发生发展中起重要作用〔3〕。因此，研究调控成骨细胞增殖、分化和凋亡的分子机制，发现具有促成骨作用的药物治疗靶点，将为骨质疏松治疗提供新途径。长链非编码RNA(lncRNA)是一类小分子非编码RNA，参与调控细胞的增殖、分化和凋亡等生命学过程，与人类多种疾病的发生发展密切相关〔4～6〕。有报道称，LINC00189在绝经后骨质疏松肾阴虚证妇女外周血单个核细胞中表达降低，可能参与骨质疏松的发生发展过程〔7〕。但LINC00189对成骨细胞凋亡和分化的影响还未见相关报道。本研究旨在探讨LINC00189对地塞米松(Dex)作用的成骨细胞凋亡和分化的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 小鼠成骨细胞系MC3T3-E1购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)购自美国Hycolne公司；α-MEM培养基、LipofectamineTM2000试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒和膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；Dex购自浙江仙琚制药股份有限公司；胰蛋白酶、p-磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/p-蛋白激酶B(Akt)信号通路抑制剂LY294002均购自美国Sigma公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒和聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司；PCR引物购自上海生工生物工程有限公司；酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3、p-PI3K、p-Akt和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体均购自美国Santa Cruz公司；LINC00189过表达载体(pcDNA-LINC00189)和空载体(pcDNA)购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养和转染 MC3T3-E1细胞用含10% FBS的α-MEM培养基培养。培养箱环境：温度37℃，5%CO2，湿度97%。及时更换培养基，当细胞融合至80%左右时，吸弃培养基，适量预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞。吸弃PBS后，加入0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。取对数生长期的MC3T3-E1细胞，以每孔1×105个细胞接种于6孔板中，当细胞融合至60%时，更换不含FBS的α-MEM培养基。分别将LINC00189过表达载体(pcDNA-LINC00189)、空载体(pcDNA)转染至MC3T3-E1细胞，具体转染过程参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书。转染6 h后，更换含10%FBS的α-MEM培养基。继续培养48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.2.2细胞分组处理 细胞以每孔2.5×104个接种于6孔板中。未进行转染的细胞分为对照组、模型组和LY294002组。对照组细胞正常培养24 h；模型组细胞用含10 μmol/L〔8〕Dex的培养基干预24 h；LY294002组细胞用含10 μmol/L〔9〕LY294002的培养基预处理20 min后，再加入10 μmol/L Dex共同干预24 h。转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00189的细胞用含10 μmol/L Dex的培养基干预24 h，记为pcDNA3.1组和pcDNA3.1-LINC00189组。转染pcDNA3.1-LINC00189的细胞用含10 μmol/L的LY294002的培养基预处理20 min后，再加入10 μmol/L Dex共同干预24 h，记为LY294002+pcDNA3.1-LINC00189组。每组设置3个复孔。

1.2.3实时荧光定量-PCR(RT-qPCR)检测LINC00189、OCN和OPN的mRNA表达 各组细胞培养后，吸弃培养基，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞。Trizol试剂提取各组细胞中总RNA，核酸分析仪检测RNA的纯度和浓度。参照逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。然后以cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增程序：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行35个循环。引物序列LINC00189正向引物5′-CTTTGTCGCCCAGGTTTGTT-3′，反向引物5′-AAAATTAGCCGGGTGTGGTG-3′；骨钙素(OCN)正向引物5′-GTGGAGGGTTCATCAGCAAC-3′，反向引物5′-AGTATGTCCTTCGTCCTGCC-3′；骨桥连接素(OPN)正向引物5′-TACCCTCCCGAGTAAGTCCA-3′，反向引物5′-CTCGGCCATCATTTGTGCTT-3′；GAPDH正向引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCACA，反向引物5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算细胞中LINC00189、OCN和OPN的mRNA的相对表达水平。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡 各组细胞培养后，吸弃培养基，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞。PBS清洗细胞。参照Annexin V-FITC/PI试剂和操作说明，取1.0×106个细胞，加入500 μl结合缓冲液，重悬细胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。加入5 μl PI，室温避光孵育5 min，流式细胞仪检测。

1.2.5Western印迹检测细胞中cleaved-caspase3、p-PI3K和p-Akt蛋白表达 各组细胞培养后，吸弃培养基，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞。PBS清洗细胞。放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液提取细胞中总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒测定蛋白浓度。取适量蛋白，100℃煮沸5 min。以每孔30 μg蛋白行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳后，将分离的蛋白湿转至聚偏氟乙烯膜，于5%脱脂奶粉中封闭，时间1 h。分别加入cleaved-caspase3(1∶1 000)、p-PI3K(1∶800)、p-Akt(1∶800)和GAPDH(1∶1 000)一抗，4℃孵育过夜。加入辣根过氧化酶标记的IgG(1∶5 000)，37℃孵育1 h。加入化学发光试剂避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1LINC00189在Dex作用的MC3T3-E1中的表达 与对照组LINCOO189水平(0.96±0.06)比较，模型组(0.21±0.02)显著降低(P<0.05)。与pcDNA3.1组LINC00189水平(0.21±0.02)比较，pcDNA3.1-LINC00189组(0.77±0.05)显著升高(P<0.05)。

2.2LINC00189对Dex作用的MC3T3-E1凋亡的影响 与对照组比较，模型组细胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组和pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-LINC00189组细胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图1、图2、表1。

图1 LINC00189对Dex作用的MC3T3-E1凋亡的影响

1～4:对照组，模型组，pcDNA3.1组，pcDNA3.1-LINC00189组图2 Western印迹检测cleaved-caspase3蛋白表达

表1 LINC00189对Dex作用的MC3T3-E1凋亡和cleaved-caspase3蛋白表达的影响

2.3LINC00189对Dex作用的MC3T3-E1分化的影响 与对照组比较，模型组细胞中OCN和OPN 的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组和pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-LINC00189组细胞中OCN和OPN 的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。见表2。

2.4LINC00189对Dex作用的MC3T3-E1中PI3K/Akt的影响 与对照组比较，模型组细胞中p-PI3K和p-Akt的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组和pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-LINC00189组细胞中p-PI3K和p-Akt的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图3、表3。

表2 LINC00189对Dex作用的MC3T3-E1中OCN和OPN的mRNA表达的影响

1～4：对照组，模型组，pcDNA3.1组，pcDNA3.1-LINC00189组图3 Western印迹检测p-PI3K、p-Akt蛋白的表达

表3 LINC00189对Dex作用的MC3T3-E1中PI3K/Akt信号通路的影响

2.5LY294002对Dex处理的MC3T3-E1凋亡的影响 与模型组比较，LY294002组细胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与LY294002组比较，LY294002+pcDNA3.1-LIN-C00189组细胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与pcDNA3.1-LINC00189组比较，LY294002+pcDNA3.1-LINC00189组细胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图4、图5、表4。

图4 LY294002对Dex处理的MC3T3-E1凋亡的影响

1～4：模型组，LY294002组，pcDNA3.1-LINC00189组，LY294002+pcDNA3.1-LINC00189组图5 Western印迹检测cleaved-caspase3蛋白表达

表4 LY294002对Dex处理的MC3T3-E1凋亡和Cleaved-caspase3蛋白表达的影响

2.6LY294002对Dex处理的MC3T3-E1分化的影响 与模型组比较，LY294002组细胞中OCN和OPN 的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与LY294002组比较，LY294002+pcDNA3.1-LINC00189组细胞中OCN和OPN 的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。与pcDNA3.1-LINC00189组比较，LY29 4002+pcDNA3.1-LINC00189组细胞中OCN和OPN 的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。见表5。

表5 LY294002对Dex处理的MC3T3-E1中OCN和OPN的mRNA表达的影响

3 讨 论

随着我国人口老龄化的加剧，骨质疏松发病率逐年升高〔10〕，严重威胁老年人尤其是老年女性的生活质量。成骨细胞的功能恢复和数量维持是目前骨质疏松治疗的研究重点。lncRNA长度超过200个核苷酸，在真核生物中广泛存在。研究显示，lncRNA在骨质疏松的发生发展中发挥重要作用〔11〕。研究表明，下调lncRNA KCNQ1OT1通过调控miR-701-3p/FGFR3轴是抑制成骨细胞增殖，并促进成骨细胞凋亡〔12〕。lncRNA Rhno1过表达通过调控miR-6979-5p/BMP2轴促进成骨细胞分化，为骨折愈合提供了新的治疗途径〔13〕。

成骨细胞是参与骨形成的关键细胞，在骨骼发育过程中分化产生骨基质，负责骨基质的合成、分泌和矿化〔14〕。骨质疏松的发病过程中伴随着成骨细胞的大量凋亡，骨形成减少，抑制成骨细胞的凋亡有助于促进骨形成〔15〕。细胞凋亡是一种程序性死亡过程，受多种基因的调控。caspase家族在诱导细胞凋亡的分子机制中发挥重要作用，caspase3是该家族的关键蛋白酶，其被激活后，裂解相应的底物，诱导细胞凋亡，被称为凋亡的执行者〔16〕。本研究结果表明Dex通过激活caspase3介导细胞凋亡过程促进MC3T3-E1细胞凋亡，过表达LINC00189可减轻Dex诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。

成骨细胞分化是介导骨形成和骨折愈合的重要过程。OCN和OPN是成骨的关键指标，可反映成骨细胞的活性〔17〕。OPN主要存在骨组织和牙齿中，可由成骨细胞分泌，参与骨改建、吸收和矿化〔18〕。OCN是骨矿化组织中的非胶原性蛋白，可由成骨细胞合成，骨组织中OCN水平能够直接反映骨形成和重建〔19〕。本研究结果说明Dex可抑制成骨细胞细胞分化，过表达LINC00189可有效促进成骨细胞分化。

PI3K/Akt信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，参与调控细胞的增殖、凋亡和分化等过程〔20〕。LY294002是PI3K/Akt信号通路抑制剂，可抑制PI3K/Akt信号通路的激活。本研究结果与相关报道结果一致〔21，22〕，表明抑制PI3K/Akt信号通路可促进成骨细胞凋亡，抑制成骨细胞分化；过表达LINC00189通过激活细胞中PI3K/Akt信号通路降低Dex诱导的MC3T3-E1细胞凋亡及促进细胞分化。

综上，Dex可诱导成骨细胞凋亡，并抑制成骨细胞分化，而过表达LINC00189可有效抑制Dex诱导的成骨细胞凋亡及促进细胞分化，其可能通过调控PI3K/Akt信号通路发挥作用，提示LINC00189有望成为治疗骨质疏松的新型靶点。