张蕊 李羿 宋丽

(成都医学院药学院，四川 成都 610500)

随着年龄增长，老年人的听觉器官开始衰老退变，双耳出现进行性和对称性的听力减退或无刺激感音，称为老年性耳鸣耳聋〔1〕。目前，我国65岁以上老年人该病发病率高达33%～48%。并且随着社会的老龄化，发病率正迅速上升〔2〕，因为老年性耳鸣耳聋发病机制复杂，再加上研究的起步比较晚，因此目前我国对该病的文献报道较少，治疗药物也不多。中医理论认为老年多虚，多虚则久聋。随着年龄增长，老年人精气衰减，致使精气不足而难以滋养耳部，出现耳鸣耳聋。因此，老年性耳鸣耳聋的治疗可以从抗衰老、补精气方面入手〔3〕。例如，具有补肾益气功效的六味地黄丸、耳聋左慈丸等用于治疗耳鸣耳聋，疗效较好。这些方剂中都含有泽泻配伍〔4,5〕。泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientale (Sam.)Juzep.的干燥块茎〔6〕。目前泽泻的研究重心多在其脂溶性部分，而较少关注水溶性部分〔7〕。实验表明，泽泻中水溶性活性成分多糖具有显著的抗氧化、抗衰老和提高免疫力作用〔8〕，对老年性耳鸣耳聋的治疗具有一定的积极意义。本研究旨在探讨泽泻多糖对老年性耳鸣。

1 材料和方法

1.1材料 实验动物：昆明种小鼠，SPF级，雄性，体重20 g左右，购自成都达硕实验动物有限公司〔动物合格证号：SCXK(川)2013-24〕。试剂与仪器：数码三目摄像显微镜(BA400，麦克奥迪实业集团有限公司)；电子分析天平(YP202N，上海菁海仪器有限公司)；紫外可见分光光度计(UV752N，上海佑科仪器仪表有限公司)。泽泻药材(180801，四川彭山产，四川新荷花中药饮片股份有限公司)，经成都医学院李羿教授鉴定为泽泻科植物泽泻Alisma orientale (Sam.)Juzep.的干燥块茎。丙二醛(MDA)试剂盒(A003-1-2，南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(A001-2-1，南京建成生物工程研究所)；D-无水葡萄糖对照品(MUST-18032905，成都曼思特生物科技有限公司)；D-半乳糖(G1804160，陕西润丰生物技术有限公司)。

1.2泽泻多糖的提取纯化 采用水提醇沉法〔9〕提取泽泻中的多糖类成分，Sevag法〔10〕除去粗多糖中的蛋白质杂质。取泽泻粉末(65目)，按料液比1∶10加入蒸馏水，于100℃下浸提3 h。抽滤，浓缩滤液。加入一定体积无水乙醇，待沉淀完全后抽滤，滤渣用无水乙醇和乙醚洗涤两次，干燥，得泽泻多糖粗品。粗品加水溶解后加入Sevag溶液(氯仿∶正丁醇4∶1)5 ml，以4 000 r/min离心10 min，分离上清液。挥干溶剂，干燥，即得。

1.3泽泻多糖的含量测定

1.3.1对照品溶液的制备 精密称取对照品D-无水葡萄糖，加入一定量的蒸馏水使其溶解，配成100 mg/L对照品溶液。

1.3.2供试品溶液的制备 精密称取1.2中制备的泽泻多糖，加入一定量的蒸馏水使其溶解，再加1 mol/L的H2SO42 ml，加热水解2 h，冷却至室温，配成100 mg/L供试品溶液。

1.3.3含量测定方法 精密量取1.3.2中制备的供试品溶液2 ml，加5%苯酚溶液1.5 ml和浓硫酸7.5 ml，混匀，静置20 min显色，在484 nm处测定吸光度，计算泽泻多糖的含量。

1.4泽泻多糖抗老年耳鸣耳聋的活性研究

1.4.1给药供试品溶液的制备 称取5 g1.2中制备的泽泻多糖，用150 ml 0.5%羧甲基纤维素钠溶液分散。

1.4.2老年性耳鸣耳聋小鼠模型的建立 将小鼠随机分成模型组，泽泻多糖组(均按500 mg/kg剂量腹腔注射D-半乳糖)，空白组(腹腔注射等量生理盐水)。每天一次，连续给药70 d。

1.4.3给药与取样 按375 mg/kg剂量灌胃给予泽泻多糖组小鼠1.4.1中制备的供试品溶液；按同等剂量灌胃给予空白组、模型组生理盐水，每天一次，连续给药28 d后，取小鼠脑组织和血清。

1.4.4血清中SOD值和MDA值的测定 采用试剂盒对小鼠血清中SOD值和MDA值进行测定。

1.4.5大脑组织听皮层病理检测 小鼠大脑组织标本按病理检验SOP程序进行脱水、修剪、包埋、切片、苏木素-伊红染色、封片等，最后镜检。测量听皮层正常神经元及异常神经元数量，并计算异常神经元百分比。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1泽泻多糖的含量测定结果 通过1.3.3中方法测定泽泻多糖的含量分别为53.92%、56.04%、54.38%、55.80%、 53.22%、55.30%，平均含量为54.78%，相对标准偏差(RSD)为2.04%。

2.2血清MDA、SOD测定结果 与空白组比较，模型组血清SOD活力明显降低，MDA含量明显升高(P<0.05)；泽泻多糖组血清SOD活力较模型组显著增大，MDA含量显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组MDA、SOD测定结果

2.3大脑组织听皮层病理检测结果 与空白组比较，模型组大脑中听皮层内神经元出现较明显损害，异常神经元数量及比例增多(P<0.05)；与模型组比较，泽泻多糖组大脑中听皮层内神经元损害程度变化不明显，异常神经元数量及比例降低，不存在统计学差异(P>0.05)。空白组：大脑组织结构完整，未见明显的炎性渗出；听皮层内神经元细胞形态正常，排列整齐；异常神经元小量，细胞颜色变深，体积缩小，内部结构不清晰，细胞核较模糊，细胞尾部偶然可见较为明显的轴突样结构；细胞间质内毛细血管丰富，神经纤维较均匀，胶质细胞形态正常，与神经元相比体积较小，未见明显的增生、坏死和炎性细胞浸润。模型组：听皮层内部分神经元坏死，细胞体积缩小，排列紊乱；细胞核缩小，细胞周围间隙变宽；细胞间质内的毛细血管、神经纤维及胶质细胞等无明显增生、坏死和炎性细胞浸润。泽泻多糖组听皮层内部分神经元坏死，细胞体积缩小，但排列较整齐；细胞核缩小；细胞间质内的毛细血管、神经纤维及胶质细胞等无明显增生、坏死和炎性细胞浸润。见表2和图1。

表2 各组听皮层病理检测结果

↑：坏死神经元图1 各组听皮层镜检结果

3 讨 论

老年性耳鸣耳聋的病因复杂多样，耳蜗螺旋器、基底膜等老化可引起感音障碍；中枢神经、内耳神经等退化可引起传导障碍；慢性疾病如高血压、高脂血症等可造成血管腔狭窄，内耳供血不足；缺乏锌元素可影响耳蜗功能等。目前的药物主要是针对内耳供血不足进行治疗，如扩血管药、降低血液黏稠度和溶解小血栓的药物及B族维生素等。

本文采用注射D-半乳糖来构建老年性耳鸣耳聋动物模型〔11〕。因为D-半乳糖可使机体细胞(包括听觉细胞)内氧化酶的活性改变，引发脂质过氧化等反应，产生各种氧化产物(如MDA)，引起细胞的老化损害和功能减退，从而导致机体衰老和听力障碍。SOD可帮助消除体内的氧自由基，减少细胞的氧化损害和老化凋亡〔12〕。镜检时，空白组动物大脑听皮层内偶见少量深色神经元，可能是由于脑组织样本在前期处理过程中极易受到外界各种因素的影响而造成的人工假象。本研究结果说明泽泻多糖具有较好的清除自由基和抗自由基损害的作用，能够较好地保护耳蜗细胞，从而对老年性耳鸣耳聋的治疗具有积极意义。但光镜下大脑组织听皮层神经元损害程度和异常神经元百分比均下降不明显，可能是由于饲养过程中部分老鼠死于打斗引起的创伤性感染，导致样本数量减少，再加上取样的局部性，使镜检结果仅能代表现有组织切片的病理趋势，因此后续研究中应进一步扩大样本量，增大给药剂量或延长给药时间。