赵福振，都 勇，蒋晓霞，李玉全，周傲白雪，李寒雪，谌升友，罗宝正

棘球蚴病又称包虫病，是一种由棘球绦虫中绦期(metacestode)幼虫寄生于人或动物体内而引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病，在世界范围内严重危害人体健康和畜牧业发展[1]。棘球绦虫目前共5种，包括细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)、多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis)、少节棘球绦虫(Echinococcusoligarthra)、福氏棘球绦虫(Echinococcusvogeli)和石渠棘球绦虫(Echinococcusshiquicus)。在我国主要存在的是细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫。棘球蚴病呈全球性分布，我国主要流行于西藏、四川、青海、宁夏等省(自治区)，其中属四川省甘孜藏族自治州最为严重[2]。目前，我国人兽之间主要流行的囊性棘球蚴病和泡型棘球蚴病分别是由细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫感染引起[3]，少有其它棘球绦虫感染人的病例。

棘球绦虫的终末宿主要是犬、猫、狐、狼等食肉类动物，牛、羊等有蹄类动物是常见的中间宿主[3]，人类通过误食绦虫虫卵被感染后也可成为中间宿主。棘球蚴中的原头蚴可在终末宿主小肠内发育成成虫，并产生虫卵。虫卵会随宿主粪便排出，影响周边水源等环境，中间宿主感染后，虫卵会在体内发育成棘球蚴，几乎可以感染任何器官(尤其是肝脏)，导致器官发生功能障碍，严重的可致死亡。棘球蚴和虫卵是棘球绦虫的不同生长阶段，遗传物质信息保持不变。本文使用实时荧光PCR技术，根据5种棘球绦虫的线粒体基因序列设计引物探针，建立一种对终末宿主和中间宿主快速、高效、灵敏的检测方法以进行早期诊断，发现问题及时进行驱虫消毒治疗等工作，在一定程度上可切断棘球绦虫的传染链条，对棘球蚴病防控环节可发挥重要作用，期望为棘球蚴病的预防和控制环节提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 样本 犬粪便样本84份，为中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所的测评样本，其中阳性样品为实验室人工感染的阳性犬粪样品，阴性样品为非棘球蚴病流行区家犬粪便样品。患病牛、羊解剖的病变组织样本及其囊液共18份，由天之泰生物技术研究院(珠海)有限公司提供，已对病变组织解剖并观察确诊为阳性；犬弓首蛔虫(Toxocaracanis)、多头绦虫(Taeniamulticeps)、猪带绦虫(Taeniasolium)、牛带绦虫(Taeniasaginata)基因组DNA各1份，为实验室保存样本；阳性质粒为含有目的基因的重组质粒，由上海旭冠生物科技发展有限公司合成。

1.2 主要试剂 荧光PCR反应试剂使用珠海宝锐生物科技有限公司的“Superstart Premix plus(Probe qPCR)”产品，DNA提取试剂盒使用Omega Bio-Tek公司的“Stool DNA Kit”产品和“Tissue DNA Kit”产品，

1.3 主要仪器设备 ABI QuantStudio 5实时荧光PCR仪，ABI QuantStudio 7实时荧光PCR仪，eppendorf 5424R高速冷冻离心机。

1.4 引物探针设计 在NCBI GenBank基因库中，针对细粒棘球绦虫(MN787561.1)、多房棘球绦虫(AB777918.1)、少节棘球绦虫(AB208545.1)、福氏棘球绦虫(AB208546.1)和石渠棘球绦虫(AB159139.1)线粒体COX1基因序列，选择高度同源区域(图1)，利用生物分析软件OLIGO 7.0设计一组特异性引物、探针(表1)。引物、探针均由赛默飞公司合成。

图1 5种绦虫蚴COX1部分序列比对及特异性引物结合位点

表1 棘球绦虫引物和探针序列

1.5 样本DNA提取 按照Omega Bio-Tek公司的“Stool DNA Kit”产品和“Tissue DNA Kit”产品的使用说明书提取。粪便样本使用“Stool DNA Kit”产品提取，病变组织样本使用“Tissue DNA Kit”产品提取。

1.6 反应体系和扩增程序 反应体系(25 μL)：实时荧光PCR反应试剂(2×)12.5 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，探针(10 μmol/L)0.5 μL，DNA模板5 μL，灭菌超纯水补至25 μL。

扩增程序：95 ℃ 5 min；(95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s)×40个循环，55 ℃ 30 s处收集荧光，报告基团为FAM。

1.7 方法建立 使用阳性质粒，通过预实验对反应条件、反应程序等参数进行测试，包括引物探针浓度、扩增程序参数。

1.8 灵敏度试验 将阳性质粒以10倍梯度进行稀释，对经梯度稀释的阳性质粒分别使用上述1.6反应体系和扩增程序进行荧光PCR检测，验证所建立方法的灵敏度。

1.9 特异性试验 以1.1中的犬弓首蛔虫、多头绦虫、猪带绦虫、牛带绦虫基因组DNA为模板，再取1.8中稀释的阳性质粒为阳性对照，使用上述1.6中的反应体系和反应程序进行荧光PCR检测，验证所建立方法的特异性。

1.10 样本检测 取1.1中样本提取的DNA作为模板，再取1.8中稀释的阳性质粒为阳性对照，按照1.6中的反应体系和反应程序进行荧光PCR检测，并与中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供的结果进行对比，以检验所建立方法对样品的检测情况。

2 结 果

2.1 样本信息 动物病变组织样本均为天之泰生物技术研究院(珠海)有限公司解剖并提供发生明显病变的样本，牛肺脏病变组织获取囊液的过程见图2。

图2 从病变牛肺脏中收集囊液

2.2 方法 结合引物探针Tm值的大小，在退火阶段使用梯度功能分别进行53 ℃、55 ℃、57 ℃反应，测试不同退火温度。确定退火温度后，对引物探针分别使用3种用量进行比对测试(引物探针浓度均为10 μmol/L)，根据扩增曲线形状、Ct值大小和荧光值综合判定，最终确定在55 ℃退火，上游引物1 μL、下游引物1 μL、探针0.5 μL的条件为最优，见图3、图4。

图3 不同退火温度结果对比

1：Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，Probe 1 μL；2：Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，Probe 0.5 μL；3：Forward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，Probe 0.25 μL

2.3 灵敏度试验 取1.1中的重组质粒作为模板，以10倍梯度稀释作为阳性样品，取107～100共8个梯度的阳性质粒，共出现8个扩增曲线，检出的最低浓度梯度是101copies/μL。曲线从左到右依次为107～100，见图5。

图5 灵敏度试验结果

2.4 特异性试验 本研究所建立的方法对犬弓首蛔虫、多头绦虫、猪带绦虫、牛带绦虫的检测均未出现扩增曲线，特异性效果良好，见图6。

N：Negative control; P:positive control

2.5 样本检测 根据所建立的检测方法对上述84份犬粪样本和18份病变组织样本及其囊液样本进行检测。结果显示，84份犬粪中共有41份样本为阳性，43份样本为阴性，其中19号和30号样本荧光PCR结果均为阴性，与中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所结果不一致，符合率为97.6%；病变组织样本18份均为阳性，结果与解剖情况完全一致。以上所有阳性结果均出现显著的扩增曲线，见图7、图8。

N：Negative control；P：Positive control

N：Negative control；P：Positive control

3 讨 论

我国棘球蚴病主要流行的地区基本为牧区或半牧区，这些地区环境复杂，常有野生动物出没，有开放的溪水等水源，故传染源分布广泛。调查研究表明，犬是人类和畜牧动物感染棘球蚴病的重要传染源，且犬等终末宿主的粪便会对环境造成污染，包括土壤和水源等，使人和畜牧动物被感染；家庭屠宰、随意丢弃患病的动物内脏又易让犬、野生动物等终末宿主进食后感染棘球绦虫，进而使人和畜牧动物增加患病风险。因此，对粪便、动物内脏、土壤[4]、水源甚至种植的蔬菜水果[5]等进行检测意义重大，可以在消灭传染源、切断传播途径两个方面预防和控制棘球蚴病。

目前棘球蚴病的检测手段主要包括影像学诊断[6]、免疫学检测[7]和核酸检测[8-9]。影像学在人群筛查方面是主要的临床诊断方法，有着准确、直观等优势，便携式超声设备的成熟也使得影像学在对动物现场诊断方面实现了突破。免疫学以ELISA最为常见，在流行病学调查方面，可通过对血清抗体和粪样中的抗原进行检测，了解流行情况和推测未来趋势。核酸检测技术可以实现不同来源样本检测的需求，使用合适的DNA提取试剂盒即可进行后续检测，相比其它两类方法还有着高特异性和高灵敏度的特点，检测通量大，在早期诊断中优势明显。综上所述，核酸检测方法更适用于棘球绦虫的终末宿主感染检测、中间宿主病变组织检测和环境污染监测。核酸检测常见有普通PCR、荧光PCR、LAMP和RPA/RAA等方法，其中以荧光PCR在操作性、检测时间、结果灵敏度、特异性和稳定性等方面均有出色的表现，在此次的新冠病例的诊断和筛查中被广泛应用。目前国内荧光PCR的试剂和仪器产业链完善，检测成本相比以往大大降低，现已广泛应用于病毒[10]和寄生虫病[11]等领域的检测。

本研究成功建立了一种基于实时荧光PCR检测棘球绦虫的检测方法，理论上适用于任何含有棘球绦虫、虫卵或幼虫的样本。该方法灵敏度高，可以检测到浓度为10 copies/μL，可适用于检测犬粪等目的基因含量不高的样本，在提取时建议使用专用提取试剂盒，这类试剂盒在提取过程中可以有效去除粪便中的各种污染物和影响PCR的抑制因子，并高效回收DNA，达到下游实验的要求，而一般的提取试剂盒无法达到要求，会影响后续的实验结果。试验中的犬粪样本为天之泰生物技术研究院(珠海)有限公司通过ELISA方法检测后的剩余样本，ELISA方法对犬粪样本进行前处理时，通过在粪样中加样品稀释液后震荡混悬，最后离心取上清的方式进行试验，针对部分离心后不能吸取上清的粪样，则重复以上步骤直至获取上清。本研究方法检测样本时，部分样本出现了Ct值偏高，其中19号和30号样本出现了未检出的情况，可能与ELISA试验中，部分样本因复检而重复前处理步骤，导致剩余样本中虫卵含量过少，影响目的基因提取有关。本研究作为通用型的棘球绦虫检测方法，无法鉴别虫种，在今后的研究可继续完善，例如可通过多重荧光PCR或普通PCR测序实现。

利益冲突：无

引用本文格式：赵福振，都勇，蒋晓霞，等.实时荧光PCR检测棘球绦虫方法的建立及应用[J].中国人兽共患病学报，2022，38(1)：29-34.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.179