◎ 聂阿真，南利华，赵雪峰，李 帅，马金华，刘定舟，贾松涛，赵林萍

（1.河南中标检测服务有限公司，河南 郑州 450001；2.郑州中道生物技术有限公司，河南 郑州 450001）

纽甜是一种甜味剂，但人工合成纽甜的安全性受到质疑，多数食品中纽甜的使用量都有最大限量值，如加工坚果和籽类的最大使用量为0.032 g·kg-1[1]。不同的仪器、人员、检测环境都会对检测结果造成一定的偏差，为了避免用“误差”的概念表示测量结果，相关部门提出使用测量不确定度对测量结果进行评定[2]。根据《检验和校准实验室能力认可准则》（CNAS-CL01：2018）[3]、《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[4]、《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL006：2018）[5]和《食品安全国家标准 食品中纽甜的测定》（GB 5009.247—2016）[6]，样品经甲酸-三乙胺-水提取液提取，C18固相萃取小柱净化后，经C18色谱柱进行分离，采用液相色谱仪（二极管阵列检测器）进行分析，通过保留时间进行定性，采取峰面积进行外标法定量。在实验过程中充分考虑样品称量、标准储备液配制、定容体积、样品回收率、标准曲线拟合和测量重复性等因素，把这些因素引起的不确定度分量合成食品中纽甜含量的不确定度计算中。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

华谱S6000高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）；OHAUS DV215CD电子天平（美国奥豪斯，感量0.01 mg）；JJ300A电子天平（感量0.01g）；SYU-10-200DTD超声波清洗仪；TARGIN TECH VXIII多管涡旋振荡器；SPE-24 Mediwax-24固相萃取装置；BT-III水浴式氮吹仪；Perfect-20VF超纯水机。

磷酸；三乙胺；乙腈（Thermo）；庚烷磺酸钠（色谱纯）；甲酸（色谱纯）；甲醇（Thermo，色谱纯）；纽甜标准储备液。

1.2 色谱条件

色谱柱：Acclaim TM 120 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）（序列号：005751)；流动相：0.02%庚烷磺酸钠溶液-乙腈；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：218 nm。

1.3 样品的处理和测定

称10 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，加30 mL三乙胺-甲酸-水提取液提取，振荡器上振荡15 min，超声波超声20 min后，用三乙胺-甲酸-水溶液定容至50 mL，混匀，离心5 min（8 000 r·min-1），过滤，吸取10 mL的过滤液，滤液用C18小柱（3 mL，250 mg）净化，用5 mL的甲酸-三乙胺-水溶液淋洗，舍弃所有的淋洗液，5 mL甲醇洗脱目标物，氮吹浓缩洗脱液，用甲酸-三乙胺-水提取液定容至2 mL，经0.45 μm水系滤膜过滤后，上机检测。

1.4 工作曲线绘制

准确移取纽甜标准储备液（500 μg·mL-1）10 μL、20 μL、40 μL、100 μL、200 μL和400 μL于10 mL容量瓶中，用35%乙腈水稀释并定容至刻度即得标准系列为0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1，以样品浓度作为曲线的横坐标，以样品峰面积作为曲线的纵坐标，绘制标准曲线。

1.5 不确定度评定数学模型

根据一些影响纽甜不确定度的主要因素和纽甜的计算公式，建立食品中纽甜测定的不确定度评定数学模型如下：

式中：X代表待测样中纽甜的含量，mg·kg-1；C代表上机浓度，μg·mL-1；V代表定容体积，mL；m代表样品质量，g；R代表回收率，%；frep代表重复性系数。

2 不确定度来源分析

从样品的数学模型、测量过程、前处理方法分析，测定食品中纽甜不确定度来源主要有称样引入的不确定度、定容过程中引入的标准不确定度、标准储备液配制引入的不确定度、标准曲线拟合引入的不确定度、回收率引入的不确定度以及反复测量引入的不确定度。

3 不确定度分量的评定

3.1 称样引入的不确定度u(m)

本实验称样量为10 g（精确至0.01 g），使用YP5002电子天平（仪器编号：ZBJC201700070），根据电子天平的校准证书，扩展不确定度为U=0.5 mg，k=2；由此得出称样量的标准不确定度为；引入称样量的相对不确定度为。

3.2 定容过程中引起的不确定度u(v)

3.2.1 容量瓶引起的不确定度

根据《常用玻璃量器》（JJG 196—2006），在温度为（25±1）℃的情况下，50 mL容量瓶（A级，单标线）的允许误差为±0.05 mL，假设其为矩形分布，则50 mL容量瓶的不确定度为：

相对标准不确定度为：

3.2.2 温度对定容体积的影响引入的不确定度

容量瓶的校准温度为21.6 ℃，环境温度在（20±5）℃时，50 mL容量瓶溶液所引起的体积变化为50 mL×3.4 ℃×2.1×10-4℃-1=3.57×10-2mL（水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1），假设其为矩形分布，则其引入的不确定度为：

相对标准不确定度为：

因此，定容体积引入的相对标准不确定度为：

3.3 标准储备液配制过程引入的不确定度u(c)

3.3.1 标准物质（纽甜）纯度引入的不确定度u(p)

证书上显示纯度为95.1%，其扩展不确定度为1.0%，取k=2，则其标准不确定度为，其相对标准不确定度为。

3.3.2 标准物质称量引入的不确定度u(z)

称量纽甜标准物质使用DV215CD电子天平（仪器编号：ZBJC201500013），根据电子天平的校准证书，扩展不确定度为U=0.12 mg，k=2；由此得出称量标准物质的标准不确定度为；标准物质称量引入的相对不确定度为。

3.3.3 标准物质定容引入的不确定度u(v)

（1）容量瓶引入的不确定度。称取标准物质定容至50 mL容量瓶中，根据《常用玻璃量器》 （JJG 196—2006），在实验室环境温度为（25±1）℃的情况下，50 mL容量瓶（单标线，A级）的允许误差为±0.05 mL，假设其为矩形分布，50 mL容量瓶的不确定度为：

相对标准不确定度为：

（2）温度对标准物质定容体积的影响引入的不确定度。容量瓶的校准温度为21.6 ℃，环境温度在（20±5）℃时。此时容量瓶中液体的温度与校准时溶液的温度不同所引起的体积变化为50 mL×3.4 ℃ ×1.0×10-3℃-1=1.7×10-2mL（有机溶剂膨胀系数为1.0×10-3℃-1），则环境温度对标准物质定容体积影响（假定为矩形分布）所引入的不确定度为：

相对标准不确定度为：

因此，定容体积引入的相对标准不确定度为：

由此得出标准储备液配制过程引入的相对标准不确定度为：

3.4 标准曲线的拟合引入的不确定度u(q)

实验人员对6个不同的标准工作液的浓度点进行测定，其对应浓度与峰面积见表1。

表1 不同浓度纽甜的标准工作液峰面积表

采用最小二乘法对纽甜的浓度X与其对应的峰面积Y进行线性回归，得到纽甜标准曲线Y=aX+b= 15 534.67X-17.776 7，相关系数为R2=1.000 0。

则标准曲线拟合引入的不确定度为：

标准工作液峰面积残差的标准差S(A)为：

标准溶液含量残差的平方和Sxx为：

式中：a为标准曲线的斜率；b为标准曲线的截距；c0为测得样品中纽甜的浓度mg·kg-1；p为c0测量次数；n为标准工作液的测量次数；A为标准溶液的峰面积。

由拟合标准曲线引入的相对不确定度urel(q)为：

3.5 回收率引入的不确定度urel(R)

样品前处理过程产生的不确定度，通过计算回收率的方式来评定，并且在平均回收率与100%存在显著性差异时，才将平均回收率作为不确定度的来源进行评估，并对实验结果进行回收率校正，否则忽略。实验以糕点为空白样品添加纽甜标准物质，做6个样品来测定纽甜的回收率，结果见表2。

表2 样品不同添加浓度所对应的回收率表

为评估对u(R)的贡献，必须先计算显著因子为：

而置信概率95%下自由度15时，查得ta.f为2.13，可见t＞ta.f，说明样品平均回收率与100%存在显著性差异，因此回收率引入的不确定度不可以忽略。

3.6 测量重复性引入的不确定度u(frep)

在重复性条件下，对同一样本重复测量6次，测得样品中纽甜的含量为1.798 mg·kg-1、1.822 mg·kg-1、 1.805 mg·kg-1、1.801 mg·kg-1、1.824 mg·kg-1和 1.799 mg·kg-1。

测量的重复性以标准偏差表示，6次测量的标准偏差按贝塞尔公式计算：

本次共测量了2个样品，其中X1=0.852，X2=0.858， 以两次测量的平均值作为检测结果，则本次测量平均值的标准偏差为：

两次测量的纽甜的平均含量为0.855 mg·kg，相对标准偏差即为测量的重复性系数frep的相对标准不确定度为：

4 合成不确定度分析计算

食品中纽甜相对标准不确定度分量汇总如表3所示。

表3 相对标准不确定度分量汇总表

合成不确定度为：

由纽甜测定的平均值X=0.855 mg·kg-1和公式uc(y)=u(X)/X得：

取包含因子k=2，扩展不确定度U为：

因此，食品中纽甜不确定度的测量结果可最终表示为X=(0.855±0.108) mg·kg-1（k=2）。