王芝燕，刘辉，李均艳，刘永利，孙慧珠

(1.常州市武进中医医院药剂科，常州 213161；2.河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050227)

咳喘合剂是常州市武进中医医院儿科特色制剂，是由麻黄(炙)、苦杏仁、蝉蜕、葶苈子、地龙、白前、甘草、金荞麦、鱼腥草、川芎、法半夏、浙贝母12味中药提取加工制成的合剂，具有止咳、祛痰、平喘的功效，用于咳嗽、支气管哮喘、肺炎等儿科呼吸道常见病症，在临床使用中疗效显著[1]。

液相色谱-质谱联用(LC/MS/MS)技术具有专属性强、快速灵敏等特点，广泛用于中药多成分同时定性定量分析[2-4]，为更全面控制药品质量，建立同时检测多个药味中多种特征成分[5-7]已成趋势。在前期的研究中，以高效液相色谱(HPLC)法测定了咳喘合剂中的芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素4种成分含量，但存在耗时长、样品处理步骤多等缺陷，本文建立了UPLC/MS/MS法同时监测咳喘合剂中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱，苦杏仁苷，阿魏酸，贝母素甲、贝母素乙特征成分，旨在建立便捷可靠的测定方法，为咳喘合剂的全面质量控制提供科学方法和依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 6500超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国AB Sciex公司)；XPE26型电子天平(美国Mettler Toledo公司，感量：0.001 mg)，XS105型电子天平(美国Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)；Integral10超纯水仪(美国Millipore公司)； KQ-5000DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)

1.2试药 对照品：盐酸麻黄碱(批号：171241-201809，含量：99.8%)；盐酸伪麻黄碱(批号：171237-201510，含量：99.9%)，苦杏仁苷(批号：110820-201607，含量：90.7%)，阿魏酸(批号：110773-201915，含量：99.4%)，贝母素甲(批号：110750-201612，含量：96.2%)、贝母素乙(批号：110751-201712，含量：97.7%)，甘草苷(批号：111610-201908，含量：95.0%)，甘草次酸(批号：110723-201715，含量：99.6%)。对照品均购自中国食品药品检定研究院。咳喘合剂(批准文号：苏药制字Z04000267)样品10批，由常州市武进中医医院生产(批号：200418，200407，200311，200225，200117，191207，190907，190719，190318，181223)。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵均为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1混合对照品溶液制备 取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含盐酸麻黄碱0.3 μg、盐酸伪麻黄碱0.8 μg、苦杏仁苷6.5 μg、阿魏酸0.5 μg、甘草苷1.5 μg、贝母素甲0.15 μg、贝母素乙0.1 μg、甘草次酸0.05 μg的混合溶液，即得。

2.2供试品溶液制备 取样品摇匀，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加入适量70%乙醇，密塞，超声处理20 min，取出，放冷，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，经孔径0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3阴性样品溶液制备 按处方比例及工艺分别制备缺麻黄、苦杏仁、川芎、甘草及法半夏、浙贝母的阴性样品，并按“2.2”项下方法制备溶液，即得。

2.4色谱及质谱条件 色谱条件：色谱柱为菲罗门 Kinetex C18柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；以甲醇为流动相A，0.1%甲酸为流动相B，梯度洗脱程序见表1；柱温：40 ℃，流速：0.3 mL·min-1；进样量：1 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序 Tab.1 Gradient elution procedures

质谱条件如下，离子源：ESI，扫描方式：正负离子扫描，监测模式：多反应监测模式(MRM)，脱溶剂气温度：500 ℃，质谱参数详见表2。

表2 定性和定量离子及质谱条件 Tab.2 MS parameters for each constituent

2.5专属性考察 分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按“2.4”项下进样分析，结果样品色谱中与对照品色谱相同保留时间处出现色谱峰，而阴性样品相应位置无相应峰，不干扰测定。结果见图1，方法专属性良好。

图1 对照品、样品、阴性样品定量离子对色谱图 Fig.1 Chromatograms of reference standards，sample and negative sample

2.6线性关系及灵敏度考察 以“2.1”项下对照品浓度为中心，配制系列浓度混合对照品溶液，分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，按“2.4”项下进行测定，以进样浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，各待测成分线性关系良好。取混合对照品溶液，逐级稀释并进样测定，以仪器的信噪比S/N为3时计算检测限(LOD)。结果见表3。

表3 各待测成分线性关系考察结果 Tab.3 Linear relationship of each constituent

2.7精密度实验 取“2.1”项下混合对照品溶液，在“2.4”测定条件下进样测定6次，测得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、阿魏酸、甘草苷、贝母素甲、贝母素乙、甘草次酸峰面积RSD分别为1.9%，2.5%，2.3%，1.5%，1.6%，0.8%，1.5%，1.4%，表明仪器精密度良好。

2.8重复性试验 分别精密量取咳喘合剂样品(批号：200418)2 mL，共6份，照正文方法制备供试品溶液，含量测定结果见表4，各待测成分RSD范围为1.1%～4.1%，方法重复性良好。

表4 8种代表性成分重复性试验结果 Tab.4 Results of repeatability test of 8 representative components μg·mL-1

2.9稳定性实验 取“2.8”项下供试品溶液1份，于 0，4，8，12，15，24 h 在 “2.4”项测定条件下进样测定，测得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、阿魏酸、甘草苷、贝母素甲、贝母素乙、甘草次酸峰面积RSD分别为1.3%，2.7%，2.6%，2.5%，1.9%，3.2%，1.5%，2.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.10回收率实验 采用加样回收法，取“2.7”项下已知含量的样品1.0 mL，共6份，精密称定，置50 mL量瓶中，分别精密加入适量浓度的混合对照品溶液1 mL，按正文方法制备供试品溶液。按“2.4”项下条件测定，计算回收率。结果见表5，平均回收率在101.1%～106.6%范围内，RSD为2.2%～4.1%，各待测成分方法准确性良好。

表5 8种代表性成分回收率实验结果 Tab.5 Results of recovery test of 8 representative components

续表5 8种代表性成分回收率实验结果 Tab.5 Results of recovery test of 8 representative components

2.11样品测定结果分析 取10批咳喘合剂样品，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，采用标准曲线法分别计算各待测成分的含量，10批样品测定结果见表6，不同批次样品测定结果偏差小，样品均一性良好。

表6 样品中8种代表性成分测定结果 Tab.6 Content determination results of of 8 representative components in samples μg·mL-1

10批样品中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、阿魏酸、甘草苷、贝母素甲、贝母素乙、甘草次酸的平均含量分别为10.704，33.034，146.783，12.086，40.518，3.670，2.082，1.608 μg·mL-1。

3 讨论

3.1分析方法的选择 本方中含12味药材，其中所含成分种类较多，采用HPLC-UV法测定时进行检测的色谱峰干扰较多，不能同时满足定性定量的需求。UPLC/MS/MS法可准确、快速，具有在高灵敏度的前提下保证高分辨率(高精度)的优点[8]，可以在16 min内同时完成8种成分的定量测定和定性分析。

3.2色谱质谱条件优化 8种待测成分性质各异，分别采用正、负离子检测模式进行了比较，结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、贝母素甲、贝母素乙4种生物碱类其[M+H]+峰响应较高，采用正离子模式检测；苦杏仁苷、阿魏酸、甘草苷及甘草次酸4种成分的[M-H]-峰响应值较高，因此采用负离子模式进行检测。为增强待测成分离子化，以0.1%甲酸溶液为水相，选定的各待测物的母离子和子离子响应良好。

3.3提取溶剂考察 取供试品适量，分别以50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇、70%乙醇溶液为提取溶剂，制备供试品溶液，按拟定条件测定。结果表明以70%乙醇为提取溶剂，可以将样品全部溶解，所测得各待测成分含量较高，因此选择70%乙醇作为提取溶剂。

多组分含量测定能更好地反映中成药的整体质量，本研究中的测定方法可以同时测定咳喘合剂中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、阿魏酸、苦杏仁苷、贝母素甲、贝母素乙、甘草苷、甘草次酸等8种特征成分的含量，具体操作简单且专属性强，为进一步评价咳喘合剂质量提供了参考。