陈小霞，谢彩杏，，梁毅锋，，秦百君，杨 昕，郑日辉，陈国忠

(1.广西中医药大学第一临床医学院， 2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530001)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由多种病因引起胰酶激活，继以胰腺局部炎性反应为主要特征，伴或不伴其他器官功能改变的常见消化系统危重病。随着人们饮食结构的丰富，我国AP的发病率不断增加，总体病死率达5%～10%，具有发病急、病情重和并发症多等特点[1]。在AP急性期，机体肠道功能紊乱常引起肠粘膜屏障功能障碍，使患者出现肠麻痹、肠梗阻、全身炎症反应综合症，甚至是多器官功能障碍综合征。因此，及时进行早期干预是防止AP发生转变、恶化的首要任务。但是，目前在AP早期，西医以非手术的对症治疗为主，预后较差，常因治疗不彻底导致复发。

中医学认为，AP病理性质以里、实、热证为主。基本病机是“腑气不通”，各种致病因素引起气机不畅，痰湿内蕴，郁久化热，久则血瘀、浊毒渐生，有形邪实阻滞中焦，从而导致“腑气不通，不通则痛”[2]。大黄具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒等功效，正契合AP的病理特点。如《神农本草经》所言：“大黄，主下瘀血，血闭寒热，破癥，积聚，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷”。并且课题组在中医复方治疗AP的520篇文献中发现，以大黄为君结合病理因素进行配伍和组方的较多，根据“急则治标”的原则，将大黄贯穿于AP治疗的始终，可极大程度地降低患者手术率、病死率及复发率[3]。而且现代药理研究也提示，以单味中药，如生大黄内服或灌肠可以明显调节大鼠肠道菌群，抑制肠道炎症反应[4]；加入大黄的复方制剂，如清胰汤、大承气汤等类方均有缓解肠麻痹等作用。但是，大黄成分多、传统功效和现代药理机制复杂，当前研究局限于单一方向，在AP中的作用机制尚不明确。

网络药理学是一种系统网络分析的新方法，能从分子水平观察药物活性成分、蛋白质、基因和疾病之间的相互关系，有利于系统性阐明大黄的药物疗效和治疗AP的规律，为进一步实验验证提供研究基础，为药物的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1本文所使用的工具如下 (1)数据库：TCMSP v2.3、TCMID、Swiss Target Prediction、Uniprot Updated to 2020、Gene Cards v1.5、OMIM Updated to 2020、STRING v11.0、Metascape Update to 2020-09-16、PubChem、PDB；(2)软件：UltraEdit v22.20.0.43、Perl语言v5.26、R语言v4.0.3、Cytoscape v3.6.0、Chem 3D v14.0、AutoDock Vina v1.1.2、Autodock Tools v1.5.6、Pymol v1.7。

1.2 提取大黄活性成分和靶点(1)在TCMSP和TCMID数据库中检索大黄的活性成分，并将前者的中药成分按关键ADME属性值：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18筛选，综合考虑药理活性和机体利用度[5]；(2)在TCMSP和Swiss Target Prediction数据库中查询大黄的靶点；(3)通过查询中国知网、PubMed数据库补充大黄最新的活性成分和靶点；(4)汇总上述大黄活性成分和靶点，去除重复值；(5)运用Perl语言在Uniprot数据库中将靶点名称进行基因名称转换，靶点为其他物种基因或无对应关系则删除；(6)用Cytoscape软件构建大黄“活性成分-药物靶点”网络，用network analyzer插件进行拓扑分析。

1.3 提取AP的靶点、大黄与AP的共同靶点以“Acute pancreatitis”为关键词，在常用疾病数据库GeneCards、OMIM中检索AP的靶点，去除重复值，并与1.2所得大黄的靶点取交集。

1.4 构建大黄治疗AP的“活性成分-疾病靶点”网络在Cytoscape软件中用文本文档和Excel文件构建大黄与AP的网络关系，并进行拓扑分析，突出大黄治疗AP关键的活性成分和靶点。

1.5 构建蛋白相互作用网络(protein-protein interaction，PPI)STRING是根据已知蛋白相互作用进行预测的数据库。将1.3所得的大黄与AP的共同靶点导入，物种限制为人类，隐藏游离点，设定置信度>0.4，其他保持默认设置，导入Cytoscape软件进行拓扑分析。

1.6 基因本体(gene ontology，GO)生物过程富集分析Metascape数据库是一个功能强大、更新快、覆盖广的基因功能注释分析工具，能分析大批量的基因或蛋白功能。将1.3所得的大黄与AP共同靶点导入，限定物种为人类，P≤0.01。

1.7 京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析将1.3所得的大黄与AP共同靶点导入R语言，获得KEGG通路富集结果，并借助R语言对关键靶点和关键通路进行分析。

1.8 分子对接验证(1)小分子化合物处理：将1.2和1.4中得到的大黄关键活性成分取交集，选取排名前三的，和目前治疗AP的主要西药：奥曲肽、加贝酯，在PubChem中分别下载sdf格式，导入Autodock Tools转存为pdbqt格式。(2)大分子蛋白处理：将1.4和1.5中大黄的关键靶点取交集，选取排名第一的在PDB数据库下载其pdb格式：人源蛋白优先；有蛋白与配体的复合物；最好蛋白的配体与AMD的结构类似。再导入Pymol中去除水分子、分离配体，在Autodock Tools中加氢、加电荷，转存为pdbqt格式。(3)设置活性口袋，利用Autodock Vina进行分子对接，计算结合能。

2 结果

2.1 研究步骤在TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction数据库中分别检索大黄的活性成分及靶点，在Gene Cards、OMIM数据库筛选AP靶点，并获得大黄与AP共同靶点。然后分别将共同靶点导入Metascape数据库进行GO富集分析、R语言进行KEGG富集分析、STRING数据库构建PPI网络。另外，通过Cytoscape软件分别构建大黄“活性成分-药物靶点”网络、大黄治疗AP的“活性成分-疾病靶点”网络，筛选出大黄治疗AP的核心活性成分及靶点。最后通过分子对接初步验证其结合能力。

2.2 大黄的活性成分和靶点在TCMSP和TCMID数据库中共得到192个大黄活性成分，查阅文献补充后去除重复值，最终得到16个，详见Tab 1。在TCMSP和Swiss Target Prediction数据库中得到大黄的靶点去重后剩645个。然后运用Perl语言在Uniprot数据库中将靶点名称进行基因名称转换，将所得的大黄活性成分和转换后的靶点基因进行映射，导入Cytoscape软件，形成由62个节点(表示大黄的活性成分和靶点)，81条边(表示成分与靶点之间的相互作用)构建的大黄“活性成分-药物靶点”网络，平均节点值为1.3。并进行拓扑分析，设置Degree≥平均节点值(即≥2)，突出大黄自身关键的活性成分和靶点。

Tab 1 Rhubarb active ingredient list

2.3 AP的靶点、大黄与AP共同靶点在GeneCards数据库中得到AP靶点1 700个，将靶点相关性评分设定为≥中位数值(即≥5.12)，保留相关性较大的靶点[6]。同时，在OMIM数据库得到182个，与2.2所得大黄的靶点取交集，在微生信平台构图，得到31个大黄与AP共同靶点。

2.4 大黄治疗AP的“活性成分-疾病靶点”网络将2.2所得的31个共同靶点运用Perl语言映射出对应的大黄活性成分，构建网络和属性文件导入Cytoscape软件，得到由38个节点和54条边构建成的网络，并进行拓扑分析，节点按Degree值进行排序。然后计算所有节点的Degree值、中心度值(Betweenness centrality，BC)、紧密中心度(Closeness centrality，CC)的平均节点值进一步筛选，当设置Degree≥2，BC≥0.12，CC≥0.40时，选出综合条件最高的前三个。

2.5 PPI网络在STRING数据库得到由27个节点，135条边构建的PPI网络，并进行拓扑分析，设置Degree≥5(平均节点值为5)，突出相互作用密切的靶点。由Fig 5可见，CASP3、JUN、HSP90AA1等为关键靶点。

Fig 1 Rhubarb “active ingredient-drug target” network

Fig 2 Common target of rhubarb and AP

Fig 3 The “active ingredient-disease target” network of rhubarb in treatment of AP

Fig 4 PPI network

Fig 5 GO enrichment analysis

Fig 6 KEGG enrichment analysis

Fig 7 p53 signaling pathway

Fig 8 Molecular docking binding energy

Fig 9 A detailed simulation diagram of molecular docking

2.6 GO富集分析在Metascape数据库中得到137个细胞生物过程，根据Count值将前20个导出，其中每个节点代表一个富集的术语(term)，相似度>0.3的term通过边连接，汇聚成功能团，根据功能团的score设置边的透明度，突出重要性。其中主要包括对有毒物质的反应(response to toxic substance)、节律过程(rhythmic process)、对非生物刺激的反应(cellular response to abiotic stimulus)、对氧气水平的反应(response to oxygen levels)、活性氧代谢(reactive oxygen species metabolic process)、DNA损伤的信号转导(signal transduction in response to DNA damage)、凋亡信号通路(apoptotic signaling pathway)等。

2.7 KEGG富集分析在R语言运行数据后得到87条信号通路，根据Count值展示前20条阳性率较高的通路，纵坐标表示信号通路，横坐标表示富集倍数，气泡大小表示富集基因的数量，不同颜色表示P值大小。在国内外文献，如中国知网、PubMed等查阅与AP相关且显著富集的通路，可知所得的乙型肝炎(Hepatitis B)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、细胞周期(cell cycle)、凋亡(apoptosis)等与AP相关。其中，结合文章所得关键靶点对排名靠前且与AP有密切联系的p53信号通路进一步构图分析。

2.8 分子对接模型课题组综合考虑药物本身作用及药物治疗疾病作用两方面，取2.2大黄“活性成分-药物靶点”网络和2.4大黄治疗AP的“活性成分-疾病靶点”网络排名前三的大黄活性成分、2.4大黄治疗AP的“活性成分-疾病靶点”网络和2.5 PPI网络排名前五的交集靶点作为大黄治疗AP的核心活性成分及靶点。将2.2和2.4的大黄活性成分取交集可知，大黄治疗AP主要且核心的前3个活性成分为beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN。将2.4和2.5的靶点取交集可知，大黄治疗AP核心的靶点蛋白为HSP90AA1。基于此，课题组认为beta-sitosterol(PubChem CID：222284)、aloe-emodin(PubChem CID：10207)、EUPATIN(PubChem CID：5317287)作用于HSP90AA1(PDB ID:3q6n)是大黄治疗AP的关键，并通过分子对接进行初步验证。而目前治疗AP的奥曲肽(Octreotide)(PubChem CID：448601)、加贝酯(Gabexate)(PubChem CID：3447)作为分子对接的阳性对照，同样进行相同操作。Autodock Vina软件中结合能<-5 kcal·mol-1说明小分子与大分子结合性很好，且值越小表示越可能自发结合。本次对接结合能均<-5 kcal·mol-1，并且beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN的结合能明显小于两个西药的结合能。将结合能最低的前二组对接细节展示，可见小分子结合在蛋白的活性口袋，并且aloe-emodin与HSP90AA1活性位点的TYR-364、ARG-346、ARG-345、ARG-386形成5个氢键相互作用，EUPATIN与HSP90AA1活性位点的PHE-369、ARG-386形成2个氢键相互作用，氢键通过原子间的虚线连接，提示分析所得的大黄关键活性成分与核心靶点之间结合性很好、构象稳定和生物活性高。

3 讨论

中医将AP归属于“腹痛”“胰瘅”等范畴，在利用大黄治疗AP的临床实践中有着历史悠久且独具特色的经验。利用系统的网络药理学结合分子对接对其在AP中发挥的作用机制进行分析，将能较大程度的在大黄多个靶点、多个通路中预测与AP密切联系的靶点、通路，从而提高临床实验效率，在进一步的实验验证中获得重大突破，为临床用药增加中医自信。

在本文中，课题组综合结果分析可知，大黄治疗AP主要且核心的前3个活性成分为β-谷固醇(beta-sitosterol)、芦荟大黄素(aloe-emodin)、泽兰黄醇(EUPATIN)，即是大黄本身主要的活性成分，也是大黄治疗AP核心的药效成分。beta-sitosterol是一种最常见的的天然植物固醇，能影响细胞膜结构，参与调节膜的相关代谢，具有降脂、抗炎等生物活性[7]。其通过减少肠道对胆固醇的吸收，能减少胰腺中游离脂肪酸的大量积累，避免活性氧簇和活性氮簇大量生成，从而抑制氧化应激机制启动，减少对胰腺细胞的脂毒性和炎性损伤[8]。另外，促炎和抗炎细胞因子的平衡对于AP炎症的进展至关重要。据报道，beta-sitosterol可下降TNF-α、IL-1β、IL-2等促炎细胞因子水平，升高IL-10和TGF-β等抗炎细胞因子水平，并降低VEGF和NF-kB表达，增加HO-1，Nrf-2表达，即抑制NF-kB，激活HO-1/Nrf-2途径，从而表现出减轻组织炎症水肿，改善微循环障碍的作用[9]。表明beta-sitosterol有通过降脂、抗氧化应激和抗炎，降低高脂血症胰腺炎往重症发展的趋势。众所周知，aloe-emodin存在于芦荟、大黄等多种中药中，是大黄蒽醌类属中较为重要的部分，初步证明本文2.1中预测大黄活性成分的可靠性。其通过清除氧自由基，减少脂质过氧化物的堆积，避免了脂质过氧化损伤，达到降低血脂目的的同时，还防止了胰腺组织的坏死[10]。并且，Gao等[11]发现，aloe-emodin能通过Nrf2/HO-1信号传导途径，抑制NLRP3炎性体激活，抑制促炎细胞因子的产生，下调caspase-1水平，有效地保护大鼠免受AP损伤。这正是对aloe-emodin治疗AP机制的进一步探索。另一方面，NO由NOS的酶家族产生，不仅在胰岛中表达，也在胰腺外分泌区室和脉管系统中，而黄花蒿属植物中的多甲氧基黄酮类化合物EUPATIN已明确具有减少NO的作用，能明显降低AP大鼠的p65、iNOS、IL-6表达，减弱巨噬细胞中NF-κB依赖性炎症，从而缓解AP早期的炎症因子风暴[12]。在2.8的分子对接中beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN与AP的主要靶点HSP90AA1结合能明显小于两个西药的结合能，正是大黄在治疗AP中生物活性较高的体现。此外，HSP90AA1是HSP90家族最重要的热激蛋白之一，是真核生物必不可少的伴侣蛋白，能调节蛋白激酶、转录因子和细胞信号蛋白的稳定性和活性，并与信号转导或信息处理有关的蛋白质保持联系[13]。其在中毒、缺氧等应激条件下会被激活，能被IL-2、NF-kB或RELA诱导表达，与急性损伤和炎症相关，常提示预后不良[14]。这就产生了一个阳性的反馈回路，易在炎症部位引起炎症性风暴。然而目前大量的研究表明，抑制HSP90AA1可通过泛素-蛋白酶途径和NF-kB信号通路增加其伴侣蛋白质降解，阻断信号通路的激活，并引起巨噬细胞和其他细胞因子的后续损失，显著减轻炎症反应[15]。

另一方面，对GO富集分析的137个细胞生物过程分析得知，有毒物质、非生物刺激、氧气水平、活性氧的代谢、DNA损伤、凋亡等大多与AP的发生发展相关。KEGG富集分析中得到87条信号通路中显著富集在p53信号通路。p53位于17p染色体上，是细胞生存或凋亡的“分子开关”，可调节DNA修复、细胞增殖和凋亡等，在DNA损伤诱导的细胞凋亡中发挥着重要作用[16]。正常情况下，p53与MDM2的产物相互作用且保持在较低水平。当细胞受有毒物质等刺激时，发生DNA损伤，ATM识别受损的DNA分子进而磷酸化Chk2，活化的Chk2又进一步磷酸化PARC，从而增加p53蛋白的表达[17]；另外，ATM也可直接磷酸化激活p53。当活化的p53蛋白积累到一定水平时，可转录激活促凋亡基因，如Bax、Caspse 9及Caspse 3，也可转录抑制抗凋亡基因，如Bcl-2，诱导线粒体途径和死亡受体途径的细胞凋亡[18]。而靶点HSP90AA1作为伴侣蛋白，从上面的分析知道，被大黄关键成分抑制后可阻止p53信号通路泛素化降解，抑制AP发展。

综上所知，大黄的beta-sitosterol等核心活性成分可通过HSP90AA1等疾病靶点干预p53信号通路，抑制细胞凋亡等过程，缓解AP的炎症反应。同时受有毒物质、非生物刺激、氧气水平等生物过程影响。