黄 通，王志刚，杜之渝

(1.重庆医科大学附属第二医院眼科，重庆 400010；2.重庆医科大学生物医学工程学院超声医学工程重点实验室，3.超声分子影像学重庆市医学重点实验室，重庆 400010)

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)是低龄儿童最常见眼内恶性肿瘤[1-2],存活率较低，且就诊患儿多已属中晚期，仅能通过摘除眼球甚至剜除眼眶内容物进行治疗[3]。纳米材料现已广泛用于治疗各类肿瘤[4]。单宁酸(tannic acid, TA)是源于植被的天然多酚类物质，可在水溶液中与FeⅢ配位而迅速形成金属多酚网状结构单宁酸铁FeⅢTA[5]，后者具有极佳的光声(photoacoustic, PA)效应，能产生稳定的PA信号[6]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]生物相容性优异[7]，可包裹第二代光敏剂二氢卟吩e6(chlorin e6, Ce6)，用于荧光标记观察Y79细胞摄取纳米粒[8]。本研究尝试制备载FeⅢTA/Ce6的新型PLGA纳米粒，观察其用于PA成像及体外杀伤Y79细胞的效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料及设备

1.1.1 材料 雄性裸鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)；人源性RB Y79细胞系(上海佰晔生物科技中心)，人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞(美国ATCC)；PLGA(分子量12 000，乳酸/羟基乙酸聚合比50∶50，山东济南岱罡生物科技有限公司)，Ce6(美仑生物技术有限公司)，六水合氯化铁(FeCl3·6H2O，赛默飞世尔科技有限公司)，单宁酸(tannic acid, TA，美国Sigma-Aldrich公司)，二氯甲烷、异丙醇(重庆川东化工集团)，聚乙烯醇[poly(vinyl alcohol), PVA，美国Sigma-Aldrich公司]，钙黄绿素(calcein, C-AM)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)[日本东仁化学科技(上海)有限公司]，南美胎牛血清(以色列Biological Industries)。

1.1.2 设备 Sonics&Materials声振仪，紫外分光光度计UV2600(日本Shimadzu)，磁力搅拌器(上海力辰邦西仪器科技有限公司)，纳米粒度仪(美国Brookhaven)；透射电镜Tecnai G2 F20，扫描电镜Apreo S HiVac(美国赛默飞)，808 nm激光仪(FC808-2W-MM，西安中川光电科技有限公司)，热红外成像仪(Fotric 226，美国Fotric公司)，激光共聚焦显微镜(日本Nikon)；PA成像仪(Vevo LAZR，加拿大Visual Sonics公司)，电感耦合等离子体发射光谱仪720ES(inductively coupled plasma optical emission spectrometer, ICP-OES，安捷伦科技有限公司)。

1.2 培养Y79细胞 将Y79细胞接种于由RMPI 1640基础培养基、20%胎牛血清及1%青霉素-链霉素组成的培养基中，置于37℃、5% CO2孵箱中培养。

1.3 制备FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒 采用双乳化法，将50 mg PLGA溶于2 ml二氯甲烷(CH2Cl2)，加入0.5 ml Ce6溶液(溶于甲醇，5 mg/ml)后置于超声清洗仪中5 min，使其完全溶解；加入200 μl超纯水，以声振仪振荡3 min进行第1次乳化，再加入8 ml 4% PVA溶液振荡3 min进行第2次乳化；加入10 ml 2%异丙醇溶液，以磁力搅拌器搅拌6 h；离心5 min(10 000 r/min)，并以超纯水清洗3次，得到PLGA/Ce6纳米粒。

取1 ml PLGA/Ce6纳米粒(0.5 mg/ml)，依次加入5 μl TA溶液(40 mg/ml)及5 μl FeCl3溶液(10 mg/ml)，置于涡旋仪15 s充分混合均匀，之后离心、洗涤3次，得到FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒，储存于4℃备用。

1.4 检测FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒基本特性 以透射电镜及扫描电镜观察FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒，并以粒度仪检测粒径及电位大小；采用紫外分光光度计及ICP-OES分别测量Ce6和FeⅢTA包封率及载药量。

1.5 检测FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒体外羟基自由基(·OH) 实验组：将20 μg亚甲基蓝(methylene blue, MB)、1×10-3mol/L H2O2及0.5 mg FeⅢTA/PLGA/Ce6溶于1 ml pH 5.5的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)；对照组：将20 μg MB、1×10-3mol/L H2O2溶于1 ml pH 5.5的PBS。将样品置于摇床并避光，振荡反应15 min(37℃，100 r/min)，以酶标仪检测其降解程度。

1.6 检测FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒体外光热效应 分别将PBS及不同浓度(2.00、1.65、1.30、0.95、0.60及0.25 mg/ml)FeⅢTA/PLGA/Ce6 纳米粒各200 μl置于96孔板，以808 nm激光(2 W/cm2)辐照10 min，同时采用热红外成像仪检测样品温度；取1.65 mg/ml FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒200 μl置于96孔板，以808 nm激光辐照直至温度达55℃后，关闭激光冷却至室温；重复进行5次。检测纳米粒光热稳定性，并计算光热转换效率。

1.7 检测FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒PA信号 将不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mg/ml)FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒置于凝胶模型中，以PA成像仪检测其PA信号。将1×106个Y79细胞重悬于100 μl PBS中接种于裸鼠右大腿根部，待肿瘤生长至80 mm3后取5 mg/ml FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒200 μl，经尾静脉注射至荷瘤裸鼠体内；分别于注射纳米粒前及2、4、6、12 h后采集PA图像。

1.8 检测FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒于Y79细胞内产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平 按5×105个/孔将Y79细胞置于12孔板中，分为激光组、FeⅢTA/PLGA/Ce6组、FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光组及空白对照组。对FeⅢTA/PLGA/Ce6组及FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光组加入1 ml FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒(0.5 mg/ml)孵育12 h，对激光组及空白对照组不做处理；离心后去除废液，加入ROS荧光探针DCFH-DA染料(DCFH-DA∶培养基为1∶1 000)，避光置于37℃、5% CO2孵箱中孵育20 min；再以808 nm(2 W/cm2)激光辐照激光组及FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒+激光组5 min，对FeⅢTA/PLGA/Ce6组及空白对照组不做处理；离心去除DCFH-DA染料，加入200 μl PBS重悬后避光并送检。

1.9 检测FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒体外安全性 按5 000个/孔将RPE细胞置于96孔板中孵育12 h，以PBS清洗3次；分别加入不同浓度(0.062 5、0.125、0.25、0.5、1及2 mg/ml)FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒(重悬于完全培养基)，共孵育24 h，以PBS清洗细胞3次；每孔加入100 μl含10% CCK-8的基础培养基，避光孵育45 min。

1.10 流式细胞术Y79细胞吞噬实验 按5×105个/孔将Y79细胞置于24孔板中，分别于0.5、1、2、3、4及5 h后于4个孔中加入100 μl FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒(0.5 mg/ml)，之后离心去除废液，加入200 μl PBS重悬，避光并送检。

1.11 检测Y79细胞凋亡 按5×105个/孔将Y79细胞置于12孔板中，对FeⅢTA/PLGA/Ce6组及FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光组加入1 ml FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒(0.5 mg/ml)共孵育12 h，之后以808 nm (2 W/cm2)激光辐照激光组及FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒+激光组5 min；对空白对照组不做任何处理。

1.11.1 流式细胞术 离心去除废液后加入200 μl PBS并送检。

1.11.2 激光共聚焦 离心去除废液后加入200 μl C-AM/PI染色液重悬，避光置于37℃、5% CO2孵箱中孵育15 min；加入PBS，离心去除染料，于共聚焦显微镜下观察。

1.12 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0统计分析软件。以±s表示符合正态分布的计量资料，以单因素方差分析行多组间比较，采用LSD-t检验进行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米粒基本特性 透射电镜示FeⅢTA呈壳状结构，PLGA及Ce6呈核状结构，FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒呈较规则圆形(图1A)。扫描电镜示所制纳米粒分散性良好(图1B)，Zeta电位为(-28.32±3.35)mV，粒径为(297.02±9.59)nm；Ce6包封率为(74.99±2.57)%，载药量为(4.16±0.15)%；FeⅢTA包封率为(4.92±0.35)%，载药量为(0.021 88±0.001 57)%(图1C)。

2.2 纳米粒体外·OH 实验组在664 nm处的特征吸收峰显著降低，即FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒消耗了MB并成功产生·OH。见图2。

2.3 纳米粒体外光热效应 加入FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒的浓度越高，经808 nm激光辐照后样品升温幅度越大，且于激光辐照6 min后趋于平稳；辐射PBS后温度未见明显升高(图3A、3B)。FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒光热稳定性优异(图3C)，光热转换率为24.70%(图3D)。

2.4 纳米粒PA信号 体外FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒PA信号强度随浓度增加而加强，二者呈线性相关(R2=0.979 5)。将FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒注入荷瘤小鼠后， PA信号随时间延长而增强(图4)。

2.5 纳米粒于Y79细胞内产生ROS水平 激光组、FeⅢTA/PLGA/Ce6组、FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光组及空白对照组ROS产量百分比分别为28.01%、55.41%、42.74%及26.57%，见图5。

2.6 纳米粒体外安全性 0.0625、0.125、0.25、0.5、1及2 mg/ml FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒对RPE细胞均无明显细胞毒性，其中细胞存活率依次为(96.90±0.60)%、(94.84±0.80)%、(93.51±0.96)%、(92.40±0.34)%、(91.14±0.50)%及(87.79±0.49)%。

2.7 Y79细胞吞噬实验 于Y79细胞中加入FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒后，随时间延长(0.5、1、2、3、4、5 h)，荧光强度逐渐增强(13.06%、59.98%、79.41%、88.57%、94.86%、99.72%)；见图6。

2.8 Y79细胞凋亡

2.8.1 流式细胞术 激光组 [(5.88±2.25)%，图6A]、FeⅢTA/PLGA/Ce6组[(10.73±1.92)%，图6B]、FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光组[(41.58±5.24)%，图6C]及空白对照组[(3.40±1.29)%，图6D]Y79细胞凋亡率差异具有统计学意义(F=99.69，P<0.000 1)；激光组与空白对照组差异无统计学意义(t=1.658，P=0.173)，其余两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图7。

2.8.2 激光共聚焦 激光共聚焦显微镜示激光组及空白对照组Y79细胞凋亡均较少，FeⅢTA/PLGA/Ce6组凋亡较多，FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光组凋亡最多。见图8。

3 讨论

ROS包括·OH、单线态氧(singlet oxygen,1O2)及过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)等，在肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中可通过扰乱氧化还原稳态平衡而诱导癌细胞死亡。H2O2是最丰富、最稳定的非自由基 ROS[9]。金属离子介导化学动力疗法(chemodynamic therapy, CDT)因特异性高、不良反应少[10]而逐渐受到关注。FeⅢTA纳米涂层可在肿瘤弱酸性微环境中分解， FeⅢ被还原成FeⅡ，继而通过与H2O2的Fenton反应产生对肿瘤细胞剧毒的·OH以诱导其凋亡[11]。已有研究[12]证实，FeⅢTA具有优异的光热转换效率、生物相容性及良好的治疗肿瘤效果。

CDT既不需要光源，亦不受局部氧含量影响[13]，但受限于肿瘤内H2O2含量；光热治疗(photothermal therapy, PTT)[14]用于RB可弥补CDT的不足。PTT指搭载光热材料的纳米制剂经局部激光照射(近红外光)可使实体瘤内温度升高[15]，以特异性杀伤局部肿瘤组织[16]。纳米技术的不断发展，使PTT展现出巨大临床应用潜能。PA成像为新兴医学成像方法，具有高分辨率及高图像对比度等优点[17]。本课题组前期研究[18]制备的载FeⅢTA和紫杉醇的纳米粒可用于RB，但化疗药物毒副作用大，且易产生耐药性。本研究采用FeⅢ和TA于PLGA/Ce6表面形成致密的FeⅢTA纳米涂层，成功制备的FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒的基本特性良好；经808 nm激光辐照后的温度均随浓度而呈线性增加，体外PA信号与纳料粒浓度呈正相关，且在体PA成像效果显著，与时间呈正相关；经DCFH-DA探针检测到该纳米粒于Y79细胞内产生大量ROS，通过MB检测证明其为·OH，提示FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒通过CDT途径产生ROS而杀死Y79细胞，协同808 nm激光可进一步提高对Y79细胞的杀伤效果；将该纳米粒与RPE细胞共孵育24 h后，RPE细胞存活率仍较高，表明其对正常眼内组织RPE无明显细胞毒性。

综上，本研究成功制备的FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒 PA成像效果较好，用于光热治疗联合化学动力疗法可有效杀伤Y79细胞；但该纳米粒对肿瘤组织无明显靶向性，有待加以改进。