胡婷婷，何 帆，刘明政，徐文华，王元银

三叉神经痛(trigeminal neuralgia，TN)是颌面外科临床常见的一种神经病理性疼痛，严重影响患者的生活质量及心理健康[1-2]。卡马西平等药物治疗易出现疲劳、头昏等副作用[1,3]。注射治疗、射频温控热凝和手术等方法也仍不能达到理想的治疗效果[1,3]。因此进一步探索TN发生的机制，寻找更精确有效的治疗方法，已成为近年来的研究热点[2,4]。

miR-30b是miR30家族的成员，参与了多种疾病的发病机制，与神经性疼痛、神经退行性疾病等有关[5-6]。目前关于TN模型大鼠三叉神经节(trigeminal ganglion,TG)中miR-30b的研究较少。激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)与周围神经损伤特异性相关，被用作神经损伤的特定标记物[7-8]。故本研究建立大鼠TN模型，通过机械痛阈测定及ATF3辅助验证模型，探索miR-30b是否参与调控TN的发生。

1 材料与方法

1.1 实验主要试剂、仪器Von Frey 毛刷(美国North Coast公司)；Tissue RNA Purification Kit Plus(上海奕杉生物科技有限公司组织)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect real Time)(日本TaKaRa生物科技有限公司) ；TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(日本TaKaRa生物科技有限公司)；Hairpin-itTM microRNA and U6 snRNA Normalization RT-PCR Quantitation Kit(上海吉玛制药技术有限公司)；荧光定量PCR仪(美国Thermo Scientific公司)；KZ-Ⅲ-F高速低温组织研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；ATF3 Antibody(江苏亲科生物研究中心有限公司，DF6660)；miR-30b agomir、miR-30b agomir NC(上海吉玛制药技术有限公司)。

1.2 实验动物及TN模型的构建

1.2.1实验动物 选用体质量(180～200) g的成年雄性 Sprange-Dawley(SD)大鼠，常规饲料饲养，自由饮水，饲养温度控制在22 ℃～25 ℃，12 h交替照明。动物实验通过安徽医科大学实验动物伦理委员会批准(批号：LLSC20190705)。实验动物均由安徽医科大学实验动物中心提供。

1.2.2TN模型的构建 选用眶下神经缩窄术(infraorbital nerve-chronic constriction injury，ION-CCI)构建TN动物模型。首先对大鼠进行1周的手术前适应性训练，剔除对Von Frey毛刷过于敏感或迟钝的大鼠，并筛选出经适应性训练后毛发和触须完整的大鼠用于TN模型的构建。大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠全身麻醉后，在左侧眶下颧弓和鼻骨结合处作一切口，长约5 mm，切口与鼻翼平行，玻璃分针分离眶下神经。ION-CCI组大鼠用两根5-0丝线结扎眶下神经，结扎线间距约2 mm。结扎力度适中，使眶下神经受到轻微压迫但未阻断其血液循环为宜。结扎完成后用3-0丝线缝合皮肤创口，涂抹红霉素软膏以预防创口感染[3,9]。

1.3 实验分组

1.3.1miR-30b在TN大鼠三叉神经节中的表达 将SD大鼠随机分成2组，即ION-CCI组及假手术组(Sham组)，6只/组。ION-CCI组于大鼠左侧行眶下神经缩窄术，Sham组除不结扎眶下神经外，其余手术步骤均与ION-CCI组相同。采用Von Frey毛刷分别测试大鼠术前1 d和术后10个时间点(术后2、4、6、8、10、12、14、16、21、28 d)时术侧触须垫区域的机械痛阈，记录阈值并对大鼠不同时间点的机械痛阈进行统计分析。通过实时定量免疫荧光反应(qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot) 检测术侧三叉神经节(TG)内ATF3和miR-30b表达变化。

1.3.2miR-30b表达变化对TN大鼠的影响 将SD大鼠随机分成3组，即ION-CCI组、ION-CCI+miR-30b agomir组及ION-CCI+scramble组，7只/组。ION-CCI造模术后第12天10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经眶下孔分别将miR-30b agomir、agomir NC(20 μmol，10 μl)1次/d，连续4 d定位注射到ION-CCI+miR-30b agomir组及ION-CCI+scramble组大鼠TG内[10]。每次给药前及最后一次注射给药后1 d，使用Von Frey毛刷进行机械痛阈测定。最后一次注射给药后1 d处死大鼠，采集术侧TG，通过qRT-PCR以及Western blot方法对各组大鼠TG中ATF3和miR-30b表达量进行检测及对比。实验所用微小RNA(microRNA，miRNA)序列见表1。

表1 miRNA序列(5′-3′)

1.4 机械痛阈测定测试于每日16：00～17：00间进行，测试前将大鼠置于安静环境中适应1 h，用 Von Frey毛刷从最小刺激强度开始依次递增刺激大鼠术侧触须垫区域，每根毛刷重复刺激5次，每次间隔时间不少于30 s，直到某一毛刷激发大鼠重复出现以下任一阳性反应3次：① 快速缩头、躲避毛刷的行为；② 快速抓咬毛刷的攻击行为；③ 连续搔抓术侧受刺激部位皮肤的行为。此时记录该毛刷所代表的刺激强度即为机械痛阈，并对大鼠不同时间点的机械痛阈进行统计分析。

1.5 qRT-PCR采集大鼠术侧TG，采用Tissue RNA Purification Kit Plus(上海奕杉生物科技有限公司)提取mRNA及miRNA；PrimeScript TM RT Reagent Kit(日本TaKaRa生物科技有限公司)、TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa生物科技有限公司)、Hairpin-itTM microRNA and U6 snRNA Normalization RT-PCR Quantitation Kit(上海吉玛制药技术有限公司)进行 cDNA的合成和PCR的扩增；荧光定量PCR仪检测TG中ATF3及miR-30b的表达情况。使用 2-ΔΔCt计算其相对表达水平。实验所用荧光定量PCR基因引物序列见表2。

表2 荧光定量 PCR 基因引物序列

1.6 Western blot采集大鼠术侧TG组织，称重后每1 mg组织加入含1%PMSF的10 μl RIPA裂解液，置于KZ-Ⅲ-F高速低温组织研磨仪中研磨。4 ℃、12 000 r/min 条件下离心10 min，吸取上清液。加入相应体积的 5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100 ℃加热10 min使蛋白充分变性，-20 ℃下保存待用。使用10% SDS-PAGE凝胶配制试剂盒制备凝胶，上样电泳后转模至PVDF膜上，TBST洗涤液反复洗涤3次，每次10 min，置于5%脱脂奶粉中，室温下摇床封闭2 h。置于一抗稀释液中(ATF3 Antibody 1 ∶1 000，江苏亲科生物研究中心有限公司，DF6660；GAPDH Zsbio，TA-08)，4 ℃下孵育过夜。PVDF 膜充分漂洗后置于已稀释好的二抗中室温孵育1.2 h。PVDF膜充分漂洗，置于显影机内设置条件曝光成像，使用Image J软件对曝光后的蛋白条带图灰度值进行统计分析，检测ATF3蛋白的相对表达水平。

1.7 统计学处理采用Grahpad Prism 8.0软件进行分析，ION-CCI组及Sham组两组间qRT-PCR 实验及Western blot 实验数据比较采用独立样本t检验。机械痛阈测定结果采用双因素方差分析。ION-CCI组、ION-CCI+scramble组及ION-CCI+miR-30b agomir组qRT-PCR 实验和 Western blot 实验数据采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠TN模型构建成功机械痛阈测定结果显示ION-CCI组大鼠术后第2～28天机械痛阈低于Sham组。术后第2天ION-CCI组大鼠机械痛阈即开始降低[Sham 组: (1.33±0.16) g，ION-CCI 组: (0.70±0.24) g]，在术后第12天时疼痛阈值达到最低[Sham 组: (1.53±0.39) g，ION-CCI组: (0.11±0.06) g]，且直至术后28天ION-CCI组大鼠机械痛阈仍低于Sham组[Sham 组: (1.53±0.39) g，ION-CCI组: (0.32±0.12) g]，F=3.965，P<0.05，见图1。qRT-PCR结果显示术后第12天ION-CCI组大鼠TG中ATF3 mRNA表达较Sham组升高，t=5.780，P<0.05，见图2A。Western blot结果显示术后第12天ION-CCI组大鼠TG中ATF3 蛋白表达较Sham组升高，t=11.18，P<0.05，见图2B。以上结果表明TN模型构建成功。

图1 ION-CCI组及Sham组大鼠在造模术后不同时间点机械痛阈的变化与 Sham组比较：**P<0.01，***P<0.001

图2 ATF3在ION-CCI组大鼠术侧TG中的的表达与Sham组比较：**P<0.01，***P<0.001

2.2 TN大鼠的术侧TG中miR-30b表达降低qRT-PCR结果显示在术后第12天，与Sham组相比，ION-CCI组大鼠TG中miR-30b的相对表达量降低，t=6.505，P<0.05，见图3。

图3 miR-30b在ION-CCI组大鼠术侧TG中的表达与Sham组比较：**P<0.01

2.3 miR-30b类似物对TN大鼠TG内ATF3的表达的影响注射miR-30b类似物后，与ION-CCI组及ION-CCI+scramble组相比，ION-CCI+miR-30b agomir组机械痛阈升高，F=21.20，P<0.05；qRT-PCR结果显示ION-CCI+miR-30b agomir组大鼠TG中ATF3 mRNA表达降低，F=8.562，P<0.05；Western blot结果显示ION-CCI+miR-30b agomir组大鼠TG中ATF3 的蛋白表达降低，F=8.353，P<0.05，见图4。ION-CCI组与ION-CCI+scramble组大鼠机械痛阈及TG内ATF3的表达差异无统计学意义。

3 讨论

miRNAs是一类长度为18～25个核苷酸的非编码RNA[11]。超过30%的人类蛋白编码基因可能受到这些miRNAs的调控[12]。成熟的单链miRNA可通过序列完全互补的方式与靶基因mRNA 3’非翻译区相结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译[11]。miRNAs在病理状态下表达异常，可能是一个潜在的治疗靶点[11]。近年来miRNAs在疼痛中的作用受到越来越多的关注，逐渐成为镇痛治疗的一个新方向[6]。CCI慢性坐骨神经缩窄性损伤后，大约有111种miRNAs表达异常[13]。Shao et al[14]研究发现在脊神经损伤模型SNL中，miR-30b可通过抑制Nav1.7的表达缓解大鼠的神经性疼痛。Su et al[15]研究发现在脊神经损伤模型SNL中，miR-30b可通过抑制大鼠背根神经节神经元和脊髓中Nav1.3的表达来减轻神经性疼痛。目前miRNAs对痛觉调控机制的研究主要集中在背根神经节、脊髓组织和坐骨神经痛等，对其在TN中的作用研究较少。故本研究重点关注miR-30b在TN模型大鼠TG内的表达及作用。

采用眶下神经缩窄模型建立TN是由Vos et al[16]于1994年首次提出的一种经典的造模方法，改编自Bennett和Xie[17]的坐骨神经慢性结扎模型，能再现TN的重要方面，模拟出TN的自发性疼痛及异常性疼痛(痛觉过敏)，通过对大鼠术侧触须垫区域进行机械痛阈测定来判断造模是否成功[3,9]。ATF3是一种转录因子，也是损伤的初级传入神经元的敏感标记物，与周围神经损伤特异性相关。ATF3在许多不同组织中被应激信号诱导。在疾病和损伤的动物研究中，包括神经结扎、HIV、糖尿病和神经毒素等诱导的神经病变，ATF3被用作神经损伤的特定标记物,可以很好地标记那些组织损伤后长期致敏的神经元[8]。故在测定大鼠机械痛阈之外，本研究通过检测TG中ATF3的表达变化辅助验证SD大鼠ION-CCI所构建的TN动物模型。

实验结果表明，与Sham组相比，ION-CCI组术后第2～28天机械痛阈降低，术后第12天达到最低值；术后第12天ION-CCI组TG中ATF3 mRNA及蛋白表达升高，提示TN模型建立成功。ION-CCI组术后第12天TG中miR-30b表达降低，提示miR-30b参与了TN的发生。为进一步了解miR-30b表达变化对TN大鼠的影响，在ION-CCI术后第12天，当大鼠TN模型稳定构建时，经眶下孔分别将miR-30b agomir、agomir NC 1次/d，连续4 d定位注射到ION-CCI+miR-30b agomir组及ION-CCI+scramble组大鼠TG内。实验结果显示miR-30b类似物干预后，TN大鼠机械痛阈升高，TG内ATF3表达降低。提示过表达miR-30b，不仅可以有效抑制TN引起的ATF3的上调，还能使大鼠的机械痛阈升高，缓解ION-CCI诱导的TN，从而确定了miR-30b可能是TN潜在的治疗靶点。

目前认为TN的实质可能是一种过度兴奋，表现为血管受压后脱髓鞘的三叉神经出现异常放电或异位动作电位[18]。电压门控钠离子通道(Voltage-gated sodium channels，VGSC)在神经元动作电位的启动和产生中起着至关重要的作用[2]。研究[14-15]

图4 各组大鼠眶下区定位注射不同时间点机械痛阈及术侧TG中ATF3的表达变化

证实，某些miRNA可通过调节VGSC表达和神经元兴奋性，参与神经性疼痛的发展。通过生物信息学预测发现miR-30b与VGSC亚型Nav1.3高度相关。由此推测在正常生理状态下，miR-30b能够抑制SCN3A(Nav1.3编码基因)由mRNA到Nav1.3蛋白的翻译。在外周神经受到损伤时，miR-30b表达下调从而减少对Nav1.3 mRNA的抑制，Nav1.3表达增加，引起神经元兴奋性增强，从而诱发TN。后续实验将进一步深入探究miR-30b调控TN的潜在机制，为TN的治疗研究提供新的方向。