姚 英，何 鑫，何欢柳，潘子赟，徐 琴，王海瑞*，张万起*

（1.成都大熊猫繁育研究基地/四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，成都 610081；2.天津医科大学公共卫生学院，天津 300070）

碘元素主要以甲状腺激素的形式调节机体的生长和代谢，碘摄入过少或者过多可导致甲状腺疾病及机体其他器官和系统的紊乱[1]，故监测机体的碘营养状态对预防甲状腺疾病及维持机体健康等有重要意义。

目前大熊猫的碘营养状况研究尚属空白。前人的研究发现大熊猫血液T3和T4水平是其他同体重大小的真哺乳亚纲动物的64%和47%[2]；此外，野生大熊猫分布在中国四川、甘肃和陕西省等典型碘缺乏的山区，食谱中竹子占比超过99%，且竹子中含有大量的生氰糖苷[3]，其代谢产物氰化物可在大熊猫体内形成高浓度的硫氰酸盐，后者可竞争性抑制机体甲状腺和乳腺对碘的吸收，增加碘的排出[3-5]，因此大熊猫的碘营养生理可能较为独特。

大熊猫会随着季节的变化采食竹子的不同部位。我们前期的研究发现竹子不同部位的碘含量差异大，竹叶碘含量高，竹茎和竹笋碘含量极低[6]。此外前人的研究表明竹子不同部位的生氰糖苷含量也存在差异，通常幼嫩的竹笋含量最高，其次是竹叶和竹茎[5,7]。亚成年阶段大熊猫生长速度快，对碘的生理需要量可能更大，是碘营养高敏感群体。因此本研究拟考察圈养亚成年大熊猫在采食不同竹子部位时的碘营养生理特征，探究适宜的监测指标，为生产中圈养亚成年大熊猫科学的饲喂方案的制定提供数据基础和理论支撑。

1 材料和方法

1.1 实验动物与试验设计

试验在成都大熊猫繁育研究基地（以下简称基地）进行，试验所有操作通过基地动物福利委员会审核。筛选19只健康的亚成年大熊猫（2～4岁，8只雌性，11只雄性），大熊猫分别在2020年11月—2021年2月采食竹叶（竹叶采食期，采购于四川绵阳）、2021年2—3月采食竹茎（竹茎采食期，采购于四川雅安、眉山、都江堰和绵阳）和2021年3—6月采食竹笋（竹笋采食期，采购于四川雅安、眉山、都江堰、汶川、乐山）。在各采食期的第28天开始代谢试验，竹叶采食期进行3次代谢试验（L1、L2和L3，间隔28 d）、竹茎采食期进行1次代谢试验、竹笋采食期进行2次代谢试验（S1和S2，间隔28 d），共计6次代谢试验，每次代谢试验持续3 d。

1.2 饲养管理

所有试验大熊猫的饲养管理参照基地正常的亚成年大熊猫日常管理规定，自由采食竹子和饮水。

1.3 样品采集

各采食期每隔7 d采集1次相应竹子食物样。为模拟大熊猫的采食模式，采集竹茎时去皮，采集竹笋时仅采集中段笋肉。每次代谢试验时，每只个体连续3 d采集1次性随机尿样。在各采食期结束时，试验个体在非麻醉状态下进行前臂静脉采血，分离血清。

1.4 实验室分析

1.4.1 竹子、尿液和血清碘含量的测定

采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS,iCAPQ,Thermo Fisher Scientific,德国）测定竹子、尿液和血清中碘的含量，使用100µg/L碲作为内标。

1.4.2 尿液硫氰酸盐含量的测定

采用离子色谱法（ICS 3000+，Thermo Fisher Scientific，美国）测定尿样中硫氰酸盐（UT）的含量。硫氰酸根标准物质购自Sigma-Aldrich（No.207799，ACS reagent，≥99%）。

1.4.3 血清和尿液甲状腺激素含量的测定

采用直接化学发光法进行游离三碘甲状腺原氨酸（fT3）、游离甲状腺素（fT4）、三碘甲状腺原氨酸（T3）和四碘甲状腺原氨酸（T4）。试剂盒（ADVIA®Centaur）购买自SIEMENS Healthineers,Inc公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4.4 尿液肌酐含量的测定

采用碱性苦味酸法在全自动生化分析仪（BK200，山东博科生物产业有限公司）上测定尿样肌酐（Cr）含量，试剂盒（C051-a）购买自长春汇力生物技术有限公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.5 数据统计与分析

数据使用SPSS25.0进行统计分析。Shapiro-Wilk用于检验数据的正态分布，非正态分布数据采用Box-Cox进行转换。尿样指标3个时期的比较采用重复测定（正态分布）或Friedman秩和检验（非正态分布）；2个时期的比较采用配对T检验。竹子部位碘含量及血样指标3个时期的比较采用单因素ANOVA，如果F检验显著，进行Tukey多重比较；血样指标竹叶采食期和竹笋采食期的比较采用配对T检验。采用Pearson或者Spearman对正态分布数据或者非正态分布数据进行相关性分析。结果以平均值（标准差）或中位数（范围）表示。以P＜0.05为显著水平，对0.05≤P≤0.10的趋势结果进行讨论。

2 结果与分析

2.1 不同竹子部位的碘含量

竹叶、竹茎和竹笋的平均碘含量分别为237.6、28.3和16.2µg/kg，竹叶的碘含量显著高于竹茎和竹笋（P＜0.05)（图1）。

图1 竹叶、竹茎和竹笋的碘含量（鲜样基础）Figure 1 Iodine content in bamboo leaf,culm and shoot(fresh matter basis)

2.2 血清碘和甲状腺激素含量

如表1所示：竹叶采食期和竹茎采食期血清碘（SI）含量显著高于竹笋采食期（P＜0.05)。竹茎采食期和竹笋采食期血清fT3含量高于竹叶采食期（P＜0.05和P=0.06)。对于血清fT4，竹茎采食期含量最高，其次是竹叶采食期，竹笋采食期含量最低（P＜0.05)。竹茎采食期血清T3含量显著高于竹叶采食期和竹笋采食期（P＜0.05)。而不同采食期间的血清T4含量无显著差异（P＞0.05)。

表1 不同采食期亚成年大熊猫血清指标Table 1 Serum indexes of sub-adult giant pandas during different feeding stages

2.3 尿碘、硫氰酸盐、fT3和fT4

测定各代谢试验中间一天随机尿样的碘、硫氰酸盐、fT3和fT4含量，结果见表2。尿碘（UI）含量在竹叶采食期-竹茎采食期-竹笋采食期间逐渐显著降低，但竹笋采食期内S2代谢试验的UI显著高于S1代谢试验（P＜0.05)。尿硫氰酸盐（UT）含量和尿fT3（UfT3）含量在不同采食期间及同一采食期的不同代谢试验间均无显著差异（P＞0.05)。竹叶采食期的尿fT4（UfT4）含量显著高于竹茎采食期和竹笋采食期，但竹笋采食期内S1代谢试验的UfT4含量显著高于S2代谢试验（P＜0.05)。

表2 不同采食期亚成年大熊猫尿样指标Table 2 Urinary indexes of sub-adult giant pandas during different feeding stages

测定尿样的肌酐含量，并计算肌酐校正尿碘和硫氰酸盐。竹叶采食期尿碘肌酐比值（UI/Cr）显著高于竹茎采食期和竹笋采食期，且竹叶采食期内3次代谢试验（L1-L2-L3）的UI/Cr逐渐增加，L3和L2代谢试验UI/Cr显著高于L1代谢试验（P＜0.05)。竹笋采食期UT/Cr显著高于竹叶采食期和竹茎采食期，而竹叶采食期内L3代谢试验UT/Cr显著高于L2和L1代谢试验（P＜0.05)。

2.4 血清碘与血清甲状腺激素的相关性

由于竹茎采食期血样数量较少，我们分析了全期SI与血清甲状腺激素的相关性，结果见图2。SI与血清fT4和血清T4均呈显著正相关（P＜0.05)。

图2 血清碘与血清fT3（A）、fT4（B）、T3（C）和T4（D）相关性Figure 2 Correlations between serum iodine and serum(A),fT4(B),T3(C)and T4(D)

2.5 尿样指标与血样指标的相关性

UI与UT在竹叶采食期和竹茎采食期呈显著正相关（P＜0.05)，UI与UfT3在竹叶采食期、竹笋采食期和全期均呈显著正相关（P＜0.05)，UI与和UfT4在竹叶采食期、竹茎采食期和全期均呈显著正相关（P＜0.05)。

由于血清碘通常反映近期内机体的碘营养状况，我们分析了L3代谢试验、竹茎采食期和S2代谢试验的尿碘和尿甲状腺激素与血清碘和血清甲状腺激素之间的相关性。UI与SI和SfT4均呈显著正相关，与SfT3呈显著负相关（P＜0.05)；UfT3与SfT3和ST3均呈显著正相关（P＜0.05)；UfT4与血清指标无显著相关性（P＞0.05)。

3 讨论与结论

碘营养与亚成年动物的正常生长发育有紧密关系，但目前尚未有关于亚成年大熊猫碘营养状态的研究报道，更无适宜的监测指标。

本试验鲜样基础的竹叶碘含量显著高于竹茎和竹笋（均值分别为237.6、28.3和16.2µg/kg），与前期研究的规律一致，但碘含量数值高于前期（竹叶192.2 µg/kg、竹茎6.1 µg/kg、竹笋7.2 µg/kg）[6]，尤其是竹茎和竹笋，可能原因是本试验采用的ICP-MS的灵敏度高于前期试验采用的砷铈催化分光光度法。目前关于亚成年大熊猫的不同部位竹子采食量还未见报道，参考基地圈养成年大熊猫的数据：竹叶、竹茎和竹笋采食期的采食量分别为9.5、12.3和25.0 kg/d[8]，估算亚成年大熊猫通过竹子摄入碘量为竹叶采食期最高，竹茎采食期最低。血清碘和甲状腺激素是反映机体碘营养状况和功能的常用指标。本试验竹茎采食期的血清碘与竹叶采食期无差异，而竹茎采食期的血清甲状腺激素含量高，竹叶采食期的尿碘水平高，这可能与机体采用多种途径维持血碘含量稳定有关[9]。竹笋采食期的血清碘和甲状腺激素T4和fT4含量低于其余两个采食期，可能是竹笋采食期过多的硫氰酸盐和低水平的碘摄入导致。

表3 全期尿样指标与血清指标的相关性Table 3 Correlations between urinary indexes and serum indexes during the whole stage

这是首次有关亚成年大熊猫甲状腺激素数据的报道。本试验亚成年大熊猫血清fT3和fT4、T3和T4均值（或中位数）分别为2.5～3.3和6.2～9.4 pmoL/L、0.3～0.6和2.8～4.4 nmoL/L，与文献中圈养成年大熊猫血清T3含量（0.3～1.4 nmoL/L）接近，但低于其T4含量（9.0～42.5 nmoL/L）[10]，这与儿童甲状腺激素参考值普遍高于成人的规律不一致[11]，差异的具体原因仍不清楚，需要进一步分析。此外，本试验发现各采食期大熊猫血清fT4和T4的变化较fT3和T3更为敏感，与血清碘含量呈显著正相关（r=0.57，P＜0.001和r=0.34，P=0.03），这与前人在儿童上发现的规律一致[8]，推测与T4向T3的转换有关。

大熊猫血样较为珍贵，因此我们考虑是否可以通过更易获得的尿样指标来反映大熊猫的碘营养状况。本试验竹叶采食期的尿碘水平与我们前期测定的亚成年大熊猫尿碘值（59.5µg/L）接近[6]。竹叶采食期的尿碘水平远高于竹茎采食期和竹笋采食期，尿碘肌酐比值在不同采食期的规律与尿碘的规律一致，推测与竹叶的高碘含量有关。且尿碘水平与血碘含量呈显著正相关（r=0.54，P＜0.001），这与Cui T.K.等[9]报道的结果一致。

尿fT3水平受不同竹类食物的影响不大，与血清fT3含量正相关（r=0.34，P=0.03）；而竹叶采食期的尿fT4水平高于另外两个采食期，与尿碘水平正相关（r=0.61，P＜0.001），与血清fT4含量仅有相关趋势（r=0.29，P=0.07），可能与机体维持血fT3含量稳定有关。

竹子所含生氰糖苷在大熊猫体内的代谢产物硫氰酸盐可能抑制机体对碘的吸收。本试验发现竹叶采食期和竹茎采食期的UT与UI显著正相关，与我们前期的试验结果[6]一致。但在竹笋采食期和整个试验期，UT与UI无相关性，这可能与竹笋采食期UT水平过高有关。

综上，本试验首次提供了圈养亚成年大熊猫采食不同竹类食物时的血清碘、血清甲状腺激素、尿碘、尿甲状腺激素及尿硫氰酸盐等数据，丰富了亚成年大熊猫生理参数的基础数据，为大熊猫碘营养监测、甲状腺疾病相关研究及科学饲喂提供参考。血清碘和尿碘随着不同采食期变化的规律说明其可作为亚成年大熊猫碘营养状况的监测指标。血清和尿样甲状腺激素随采食期的变化及相互之间的相关性说明血清fT4、fT3和尿fT3可作为亚成年大熊猫甲状腺功能的监测指标，但尿样指标的指示性次于血清指标。