刘茂希，杜昆利

(1.山西省肿瘤医院结直肠外科，山西 太原 030013；2.第四军医大学附属西京医院消化外科，陕西 西安 710032)

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其严重危害着人类健康。以手术为主的综合治疗明显改善了结直肠癌的生存率，但是其总体生存率仍有待提高，因此寻找新的结直肠癌治疗方案迫在眉睫。探讨结直肠癌的发病机制，寻找结直肠癌的治疗靶点是目前的研究热点之一。磷脂酶D2(PLD2)作为PLD家族的重要成员之一，在多种肿瘤中发挥了重要作用。课题组前期研究发现PLD2在结直肠癌组织中的蛋白和mRNA表达水平升高，并且其与结直肠癌患者的肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、生存率等相关[1]，且其在结直肠癌中起到抑制凋亡的作用[2]。然而在体内实验中，干扰PLD2基因表达是否对结直肠癌的生长有影响，目前尚鲜见相关报道。本实验拟通过构建结直肠癌裸鼠转移瘤模型，构建PLD2特异性小干扰RNA(ad-PLD2-siRNA)的表达载体注射裸鼠移植瘤，探讨应用RNA干扰法下调结直肠癌裸鼠移植瘤中PLD2表达水平对结直肠癌细胞生长的影响，期望能为结直肠癌的基因治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 30只BALB/c雄性裸鼠，SPF级，鼠龄4～5周，体重16～20 g,由山西省肿瘤医院动物实验中心提供。

1.1.2细胞和腺病毒 SW480和SW620细胞由本课题组前期冻存；ad-PLD2-siRNA腺病毒载体由上海汉恒生物技术有限公司构建和鉴定；本研究干扰PLD2有效的PLD2-siRNA靶序列为：5′-GAT GAG ATT GTG GAC AGA ATC CTG-3′。只带腺病毒载体而无有效序列的腺病毒作为阴性对照。

1.1.3试剂 胎牛血清和RPMI1640；PLD2抗体(美国Abcam公司)；β-actin、c-Myc和Bcl-2抗体购自武汉三鹰生物科技有限公司；Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量反应试剂盒购自大连TaKaRa公司；蛋白提取试剂盒、蛋白浓度检测试剂盒、电化学发光(ECL)液及PVDF膜购自中国碧云天生物科技有限公司；裸鼠购自重庆医科大学动物实验中心。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染 将SW480或SW620置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，5%CO2、37 ℃恒温箱中培养。收集处于对数生长期的结肠癌细胞(5×105mL)，接种到6孔板内，培养24 h贴壁后，弃培养液，加入用培养液稀释的携带PLD2-siRNA的腺病毒载体或空载体[SW480的感染复数(MOI)=40；SW620的MOI=60]，细胞转染4 h后，更换培养液并培养24 h，用荧光显微镜观察转染情况并进行后续研究。

1.2.2建立结直肠癌裸鼠移植瘤模型 (1)所有动物均先饲养7 d，离心消化SW480和SW620细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬并计数细胞使得每100微升PBS中至少重悬的细胞个数为3×106，并装在EP管中备用。(2)酒精消毒小鼠右侧背部皮肤，用1 mL注射器从EP管中吸净细胞并注射在裸鼠右侧后背部皮下，棉签轻压注射部位10 s，2种结直肠癌细胞株均注射10只。(3)用游标卡尺测量瘤体的横径(L)和纵径(S)，每3天1次，根据公式0.5×L×S2计算肿瘤体积。(4)当肿瘤体积达到50～70 mm3时，瘤体内多方向注射携带人PLD2-siRNA腺病毒或空病毒载体或生理盐水，从而将2种细胞株均分为PLD2干扰组、空载组和正常组，每组各5只，第1次注射后每3天1次，共8次后处死裸鼠，分离肿瘤，称重。每个瘤体取一部分保存于液氮以备后续蛋白和mRNA检测用；一部分用4%的甲醛固定，以备后续进行免疫组织化学染色时用。实验期间仍每3天测量瘤体的L和S。(5)根据所测的最大L和最大S，计算肿瘤体积并绘制生长曲线。(6)比较2种细胞株2组间的瘤体体积。

1.2.3蛋白质印迹法 按照蛋白提取试剂盒的相关说明提取各组蛋白，测定蛋白浓度。将各组蛋白(50 μg)在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，分离蛋白质样本，将蛋白质样本电转至PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，然后孵育二抗2 h，洗膜后用ECL液在Fushison成像系统中进行显影摄像，之后利用该系统进行表达水平分析。

1.2.4实时荧光定量PCR 按照RNA提取试剂盒的相关说明提取各组总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录。PLD2引物的序列，上游为：5′-GTGGGCGATGAGATTGTGGAC-3′；下游为：5′-CAGGATTGAATACCCCCAC GA-3′。β-actin引物序列，上游为：5′-CCACAAATC TCCTCAACTCC-3′；下游为：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′。荧光定量PCR采用SYBR®Premix EX TaqTMⅡ，按照试剂盒的相关说明进行。目的基因mRNA相对于β-actin mRNA的相对表达量按公式2-ΔΔCt进行计算，重复3次的平均值代表目的基因mRNA的相对表达水平。

2 结 果

2.1腺病毒转染效率 腺病毒转染SW480和SW620细胞24 h后在荧光显微镜下观察细胞转染效率达90%，见图1。

A、C分别为明视野下的SW620和SW480；B、D分别为绿色视野下的SW620和SW480。图1 腺病毒转染SW620和SW480后荧光显微镜图(200×)

2.22种细胞各组瘤体组织PLD2 mRNA表达水平比较 2种细胞PLD2干扰组的PLD2 mRNA表达水平与正常组和空载组相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；2种细胞正常组与空载组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

与正常组比较，aP>0.05；与正常组和空载组比较，bP<0.05。图2 2种细胞各组瘤体组织PLD2 mRNA表达水平比较

2.32种细胞瘤体组织PLD2蛋白表达水平比较 2种细胞PLD2 干扰组PLD2蛋白表达水平与正常组和空载组相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；2种细胞正常组PLD2蛋白的表达水平与空载组比较无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

与正常组比较，aP>0.05；与正常组和空载组比较，bP<0.05。图3 2种细胞各组瘤体组织PLD2蛋白表达水平比较

2.42种细胞各组瘤体体积比较 通过绘制瘤体的生长曲线，发现从第21天开始PLD2干扰组的瘤体体积开始小于空载组和正常组(P<0.05)，然而空载组和正常组间体积无差异(P>0.05)，见图4A；瘤体体积的比较，发现PLD2干扰组瘤体体积显著低于空载组和正常组(P<0.05)，而正常组和对照组间无显著差异(P>0.05)，见图4B。这些研究结果提示干扰PLD2基因表达可以抑制结肠癌的生长。

A.瘤体生长曲线；B.瘤体体积；C.各组瘤体体积比较条形图。与正常组比较，aP>0.05；与正常组和空载组比较，bP<0.05。图4 2种细胞各组瘤体体积比较

2.5干扰PLD2基因表达对瘤体组织c-Myc和Bcl-2蛋白表达水平的影响 PLD2干扰组c-Myc的蛋白表达水平与正常组和空载组相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而Bcl-2的表达水平明显升高(P<0.05)；而正常组和空载组比较两者的表达水平无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

与正常组比较，aP>0.05；与正常组和空载组比较，bP<0.05。图5 2种细胞各组瘤体组织c-Myc和Bcl-2蛋白 表达水平比较

3 讨 论

结直肠癌作为常见的消化道实体肿瘤之一，缺氧是其发生发展过程中的固有特点[3]。肿瘤细胞通过一系列机制调节自己以适应缺氧的微环境并得以生存。WU等[4]通过干扰缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因后进行蛋白质组学分析发现PLD2表达水平下降明显，提示PLD2可能在结直肠癌的发生发展中发挥了重要作用。

PLD2作为磷脂酶家族重要成员之一，其催化磷脂酰胆碱为磷脂和胆碱，后两者可参与一系列信号的转导从而参与多种生理和病理过程。过去的研究证实PLD在多种肿瘤中发挥作用，但是对于其在肿瘤中的具体作用目前依然尚未完全阐明。课题组前期研究也发现PLD2在结直肠癌组织和细胞中表达水平升高，且PLD2与结直肠癌的淋巴转移、肿瘤大小、TNM分期等呈正相关[1]。因此，推测PLD2可能促进结直肠癌的发生、发展。目前尚鲜见应用体内实验来探讨PLD2对结直肠癌生长影响的相关报道。为了探讨这一科学问题，本课题组选择裸鼠作为本实验研究对象。由于裸鼠无胸腺和T细胞功能完全缺失导致对移植物不产生排斥反应，目前用于人类肿瘤异种移植已被学者们所接受[5]，此外RYGARRD已经于1969年成功建立了该移植瘤模型[6]。本研究通过建立结直肠癌裸鼠腺病毒移植瘤模型，发现干扰降低PLD2基因的表达可以抑制结直肠癌细胞的生长。在注射腺病毒后的即第21天开始，PLD2干扰组的瘤体即显著小于对照组，表明PLD2可能促进了结直肠癌细胞的生长。YAO等[7]报道PLD可以通过c-Src相互作用协同促进细胞的增殖；过表达PLD2的成纤维细胞生长特性和形态学变化发生改变后，表现出恶性转化的特点，即处于S期细胞比例增加和细胞周期素D3的表达上调[8]，显示PLD2促进肿瘤细胞增殖。此外，PLD2可以激活mTOR通路调控多种蛋白的合成促进癌细胞生长[9-11]。有研究也报道核因子-κB可以介导PLD促进乳腺癌细胞的生长[12-13]。这些结果说明PLD2处于多条信号通路交汇点，从而参与肿瘤的发生、发展。同时本研究发现缺氧诱导PLD2表达水平和活性升高，并且HIF-1α可以调控PLD2的表达[1]；有报道指出慢性风湿性关节炎中PLD2可以调控HIF-1α的表达[14-15]。因此，推测这两者之间也可能存在Cross-talk的现象，从而促进结肠癌细胞的生长。不管怎样，这些结果说明高表达的PLD2促进结肠癌的发生。目前关于PLD2调控结肠癌生长的靶基因尚未明确。已有文献报道c-Myc和Bcl-2在结直肠癌的生长过程中发挥了重要作用。那么PLD2是否可以通过对c-Myc和Bcl-2的影响来调控结直肠癌的生长呢，现有的相关资料尚不能证实这一科学问题。为了说明这个问题，本研究通过腺病毒干扰降低PLD2基因表达，检测c-Myc和Bcl-2表达水平的变化。结果发现，随着PLD2表达水平的降低，c-Myc蛋白表达水平也下降，而Bcl-2的表达水平升高，提示PLD2可能通过调控c-Myc和Bcl-2表达来调控结直肠癌的生长。

综上所述，在结直肠癌中高表达的PLD2可能通过调控c-Myc和Bcl-2表达来参与结直肠癌细胞的发生，本研究显示PLD2可能成为结直肠癌靶向治疗的新靶点。但是PLD2作用的具体分子机制和信号通路还有待进一步深入研究。