陶香林，吴欢，孙恩涛，叶长江，文育锋

（1.皖南医学院检验学院，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院公共卫生学院）

结核分枝杆菌耐药已成为结核病防控的重大挑战［1］。因结核分枝杆菌的细胞壁的多肽多糖层周围有大量的分枝菌酸，不仅阻止抗菌药物等进入结核分枝杆菌内，还能帮助结核分枝杆菌逃避宿主免疫系统的识别［2-3］。因此，参与合成分枝菌酸的酶已成为治疗耐药性结核病的有效药物靶点。在这些酶中，S-腺苷蛋氨酸依赖甲基转移酶（SAM-MTs）被证明对分枝菌酸的合成和化学修饰起重要作用［4-5］。SAM-MTs是甲基转移酶家族的一种［6］，参与细胞壁内氨基酸、脂肪等物质的形成和转化。有研究表明，SAM-MTs能在分枝菌酸的特定位置引入关键的化学修饰，这对结核分枝杆菌的毒力和细胞壁通透性至关重要。编码SAM-MTs中间体的基因失活会抑制分枝菌酸的合成［7-8］。根据GenBank数据库，在结核分枝杆菌H37Rv株中至少有12个基因编码SAM-MTs，Rv1729c基因是其中之一。此外，已有研究表明Rv1729c基因可能与异烟肼耐药相关［9］，但其具体机制和功能仍未明确。本研究对Rv1729c基因的生物学功能进行了初步研究，以探索结核分枝杆菌耐药的潜在靶点。扩增、克隆并表达Rv1729c基因，并利用生物信息学工具对Rv1729c基因的生物学特性进行预测和分析。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体 结核分枝杆菌H37Rv菌株由江苏省疾病控制中心慢性传染病防治所惠赠。感受态的大肠杆菌DH5α和BL21购自天根生物科技（北京）有限公司，pET28a和pMD-19T质粒购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 主要试剂 2×Taq Master Mix、质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生物科技（北京）有限公司。

1.3 结核分枝杆菌基因组DNA的提取 用接种环刮取少量H37Rv菌株培养菌苔，在磨菌管中将其磨碎，加入500 μl STE（0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液重悬菌液。100℃煮沸30 min灭活菌体。12 000 r/min离心20 min，沉淀重悬于 500 μl TE缓冲液（10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）中。加入蛋白酶K至终浓度0.5 mg/ml，10%SDS溶液至终浓度0.5%，56℃孵育1 h。加入等体积的Tris-Cl饱和酚，轻轻上下颠倒混匀约5 min，以使蛋白充分变性，12 000 r/min离心5 min，取上清。小心吸取上清至另一干净1.5 ml离心管，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），12 000 r/min离心5 min，取上清。重复本步骤，直至分界面几乎看不到白色的蛋白层为止。小心吸取上清至另一干净1.5 ml离心管，加入2倍体积的无水乙醇、1/10倍体积的3mmol/LNaAC（pH5.2）溶液，充分混匀，于-20℃放置约1～2 h沉淀DNA，12 000 r/min离心20 min。小心倒弃上清，沉淀用500 μl 70%乙醇离心洗涤2次，置于超净台上室温吹干，最后将其溶解于200 μl含有RNA酶的TE缓冲液中，-20℃保存备用［10］。

1.4 引物设计与合成 根据Genbank中H37Rv的Rv1729c基因编码序列，长度为939 bp。用Primer 5.0软件设计引物，上游引物5′-ATTCTCGAGCGGTGAAATGGAAGAGTG-3′，下 游 引 物 ：5′-ATAGAATTCGACGACGACAACTGGGAT-3′，分别插入Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 目的基因PCR扩增 以H37Rv基因组DNA作为模板进行PCR反应。PCR扩增体系（50 μl）：无菌双蒸水 22 μl，2×Taq Master Mix 25 μl，上、下游引物各1 μl，DNA模板1 μl。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 克隆载体的构建 将PCR产物纯化回收与克隆载体pMD-19T经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，然后将酶切产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。按照1∶3的比例用T4连接酶16℃过夜连接，并设立对照组。转化大肠杆菌DH5α后，采用质粒的快速抽提方法及酶切筛选鉴定重组子。挑取单克隆送宝生物工程（大连）有限公司公司测序，通过NCBI上的Blast进行比对分析。

1.7 Rv1729c基因的表达和纯化 重组质粒pET-28a-Rv1729c转化大肠杆菌BL21感受态细胞。重组体在含50 μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上筛选。采用不同浓度的IPTG（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L）、不同诱导时间 （1、2、3、4、5、6、7、8 h）和不同温度（20、24、28、32、36、40、44℃）诱导表达重组蛋白。提取蛋白进行12%SDS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色后观察蛋白条带。

细胞裂解液过HisPur™Ni-NTA柱，蛋白用15 ml洗脱液洗脱（50 mmol Tris，200 mmol NaCl，500 mmol咪唑），小心吸取上清液进行12%SDS-PAGE电泳检测。

1.8 Rv1729c基因编码SAM-MTs的生物信息学分析 用蛋白质分析系统Expasy中的在线工具Protparam对蛋白质的一级结构及氨基酸组成、相对分子质量、理论等电点、分子式、半衰期、不稳定系数、脂肪系数等理化性质进行分析；用ProtScale对分析蛋白的亲（疏）水性。用Signal P 4.1 Server信号肽分析服务器预测信号肽及位置；应用TMHMM Server v.2.0分析蛋白跨膜区螺旋；用SSPro：Secondary Structure服务器预测蛋白质二级结构。利用Motif Scan分析蛋白的翻译后修饰位点。将蛋白序列提交至蛋白质分析系统EXPASYP Proteomic三级结构模型组装软件SWISS-MODEL模拟蛋白的三级结构［11-14］。利用ABCpred预测SAM-MTs蛋白的B细胞抗原表位；HLA-A*0201限制性CTL细胞表位采用IEDB和NetMHC 4.0 Server来预测［15-16］。

2 结果

2.1 Rv1729c基因的扩增、克隆及序列分析Rv1729c基因经PCR扩增，产物大小与预计相符，约923 bp（图1A）。将PCR产物克隆于pMD-19T中（图1B）和pET-28a质粒中（图1C），挑选经酶切鉴定正确的克隆，经正反向全自动序列分析显示，Rv1729c基因的GC含量为62.73%，起始密码子和终止密码子分别为GTG和UGA，所得序列结果通过NCBI的Blast进行比对分析，与MTB标准株核苷酸同源性为100.00%，在结核分枝杆菌H37Rv株全基因组中位于1954631～1955569。

2.2 Rv1729c基因编码的SAM-MTs蛋白的表达 重组质粒pET-28a-Rv1729c转化大肠杆菌BL21感受态细胞并诱导表达蛋白。SDS-PAGE显示SAMMTs蛋白成功表达，分子量约35 kDa。在不同的诱导时间、不同的IPTG浓度和不同的温度下诱导蛋白，确定最佳诱导条件：IPTG的浓度为0.4 mmol/L，时间为7 h，温度为20℃，见图2、3、4。

图3 不同的诱导时间下SAM-MTs（Rv1729c）蛋白表达情况

2.3 SAM-MTs（Rv1729c）蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析成功纯化 纯化结果显示目的蛋白为分子量约35 kDa的可溶性蛋白（图5A）。在NC膜上检测到一条35 kDa分子量的强条带，对相同样品进行Western blot分析，证实所观察到的蛋白条带与特异性抗体发生了反应（图5B）。

2.4 Rv1729c基因编码SAM-MTs的生物信息学分析

2.4.1 SAM-MTs的理化性质 Rv1729c基因编码SAM-MTs由312个氨基酸组成，其中含量最多的氨基酸为Ala和Leu，分别占13.8%和9.6%。该蛋白理论相对分子量为33 654（33.654 ku），原子总数4 722，分子式为C1496H2352N408O457S9，理论等电点4.75，带负电荷氨基酸残基（Ala+Glu）总数为39，带正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数为28，脂溶性系数91.41，半衰期30 h。不稳定指数31.41，低于阈值40，分类为稳定蛋白。利用ProtScale对蛋白的亲疏水性进行预测，疏水性平均得分-0.006（正值和负值分别代表疏水性和亲水性）（图6），为亲水性蛋白。利用在线软件SignaIP 4.1预测氨基酸的序列中无信号肽。运用TMHMM server v.2.0软件分析SAM-MTs位于细胞膜表面，不是跨膜蛋白。

图6 Rv1729c基因编码的SAM-MTs蛋白的亲（疏）水性

2.4.2 SAM-MTs的二级结构 利用在线分析软件，在线提交Rv1729c基因编码SAM-MTs的氨基酸序列后，分析得到蛋白质二级结构，其中无规则卷曲（C）148个（占47.4%），α螺旋（H）127个（占40.7%），β折叠（E）37个（占11.9%）（图7），提示该蛋白和螺旋无规则卷曲含量高，结构较松散。

图7 Rv1729c基因编码SAM-MT的二级结构

2.4.3 SAM-MTs的翻译后修饰位点 经Motif Scan分析，Rv1729c基因编码的SAM-MTs共有2个N-糖基化位点（95～98、01～204），6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（4～7、66～69、109～112、141～144、271～274、279～282），4个酰基化位点（16～21、146～151、209～214、269～274）。

2.4.4 SAM-MTs的三级结构 利用SWISS-MODEL模拟Rv1729c基因编码SAM-MTs的三级结构，9～297为氨基酸序列与putative S-adenosyl-l-methionine-dependent methyltransferase ML2640能够进行同源建模。

2.4.5 B细胞抗原表位 通过ABCpred server预测SAM-MTs的B细胞抗原表位为18～33、24～39、34～49、 55～70、 116～131、 126～141、 149～164、228～243、 245～260、 268～283、 283～298 和 290～305等，其中最具优势的5个抗原表位（临界值为0.85），见表1。

2.4.6 T细胞抗原表位 通过NetMHC和IEDB在线的HLA-A*0201对SAM-MTs蛋白预测分析，得到限制性CTL细胞8个优势表位（百分比排名＞90%） 为 32～40、 94～102、 122～130、 136～144、149～157、224～232、258～266和272～280，见表2。

3 讨论

Rv1729c是编码SAM-MTs的基因之一，参与了分枝菌酸修饰，但其具体功能和机制尚未被研究。有研究表明，敲除SAM-MTs编码基因可抑制分枝菌酸的合成，从而降低细胞壁对药物的通透性［4，17］。此外，Rv1729c基因被认为与结核分枝杆菌耐异烟肼有关［7，9］。

本研究成功扩增H37Rv标准菌株Rv1729c基因并克隆表达。该蛋白诱导表达IPTG的最佳浓度为0.4 mmol/L，最佳表达时间为7 h，温度为20℃。Western blot鉴定表达蛋白分子量为35 kDa。

本研究表明SAM-MTs是一种稳定的、疏水的、非跨膜的、结构松散的蛋白，其理论等电点为4.75。亲水性分析表明，SAM-MTs的亲水性位点与SAM-MTs的抗原位点高度相关。在结核分枝杆菌中识别SAM-MTs的B细胞表位和T细胞表位可激发特异性免疫反应，包括了解其发病机制、开发诊断方法、设计基于肽基的疫苗以预防感染［18］。本研究通过在SAM-MTs中发现具有潜在优势的B细胞和T细胞表位，探讨SAM-MTs在耐药中的作用。此外，抗原表位赋予了抗原特异性，抗原表位可以通过蛋白二级结构分析预测［19］。结果表明，SAM-MTs是一个结构松散的蛋白，具有47.4%的无规卷曲，11.9%的β-转角二级结构。二级结构表面的无序卷曲和β-转角有利于抗原与抗体的结合，成为抗原表位的首选。三级结构同源性建模显示SAM-MTs与假定的S-腺苷甲硫氨酸依赖甲基转移酶ML2640具有高度相似的序列。这一发现提供了更多SAM-MTs的立体构象信息，对研究SAM-MTs的结构与功能关系具有重要意义。在SAM-MTs中有2个N-糖基化位点、6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个酰化位点，这些位点对SAM-MTs的加工、成熟和生物调控至关重要［20］。