贾晓彤，何小娟，封吉猛,2,3，沈剑,2,3，王欣泽,2,3*

1.上海交通大学环境科学与工程学院

2.洱海湖泊生态系统野外科学观测研究站

3.上海交通大学云南(大理)研究院

随着经济社会的快速发展，我国城镇污水产生量迅速增加，导致城镇污水处理厂尾水排放量逐年增长。近年来，国家层面对水环境保护要求不断提高，特别是对于水环境敏感的地区，现有污水处理厂排放标准无法满足水环境质量的整体要求。GB 18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》[1]一级A标准中，氨氮、总氮（TN）和总磷（TP）排放浓度分别为5、15、0.5 mg/L，而 GB 3838—2002《地表水环境质量标准》[2]Ⅴ类水质标准中氨氮、TN和TP排放浓度分别为 2.0、2.0和 0.4〔湖（库）为 0.2〕mg/L，二者相比还有较大差距[3]。污水处理厂尾水排放导致大量氮、磷营养盐进入水体，易引起水体富营养化[4]。为了减轻污水处理厂尾水对受纳水体的污染，对其进行深度处理，降低氮、磷浓度很有必要。

微藻可吸收利用水环境中的氮、磷，合成用于生长繁殖的有机物，其去除氮、磷的效率高于其他微生物[5]，国内外已有一些关于微藻深度处理污水处理厂尾水的研究[6-7]。利用单一微藻处理污水处理厂尾水时，存在处理周期较长、系统不稳定等问题。为了克服上述问题，可以利用菌藻共生系统深度净化污水处理厂尾水。

在菌藻共生系统中，细菌和微藻主要通过营养交换的形式相互作用处理污水，达到物质转换和营养循环，将水环境中的氮、磷转化为微藻自身物质，以达到深度处理的目的。Lü等[8]提出建立菌藻共生体系是增强氮、磷去除和增加脂质生产的有效方案。Lananan等[9]提出菌藻共生有助于提高污水处理效率，同时微藻可以被回收利用，用于生物质生产[10]。本研究通过筛选适合的菌藻进行共培养，并采用响应面法优化培养条件，以期为构建稳定高效的菌藻共生系统提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用微藻为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，购于中国科学院水生生物研究所。蛋白核小球藻环境适应性强、生长速率快，利用水中氮元素转化得到高价值的含氮化合物的优势突出[11]。试验用细菌菌种为地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽胞杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis）、水生异常球菌（Deinococcus aquaticus）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）和硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducens），均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。试验所用污水为模拟污水处理厂尾水，由于BG11培养基可以为尾水配制提供碳源、氮源、磷源以及微量元素，因此根据BG11培养基的成分进行改进配制污水处理厂模拟尾水[12]，配好的模拟尾水TN和TP理论浓度分别为20和1.0 mg/L。

1.2 试验设计

1.2.1 微藻培养试验

取一定量的蛋白核小球藻藻液，离心清洗后接种到BG11培养基中，置于光照培养箱内（温度为25 ℃，光照强度为 2 000 lx，光暗比为 12 h∶12 h），每天定时摇动3次。每天定时取藻样，测定蛋白核小球藻的吸光度（OD680，微藻常采用680 nm的波长测定OD680），绘制得到蛋白核小球藻生长曲线，由生长曲线选取处于对数生长期的藻用于试验。

1.2.2 优势菌藻组合筛选试验

在模拟尾水中接种0.3 g/L的蛋白核小球藻，细菌常采用600 nm的波长测定OD600，试验组分别投加OD600为0.2（细菌接种体积比为5%）的5个菌种，与蛋白核小球藻进行共培养，对照组为蛋白核小球藻单独培养。共设置6组试验，恶臭假单胞菌试验组为B1，地衣芽胞杆菌试验组为B2，枯草芽胞杆菌枯草亚种试验组为B3，水生异常球菌试验组为B4，硝基还原假单胞菌试验组为B5，对照组为C。每组设置3个平行。温度为25℃，光源为LED白光，光照强度为6 000 lx，光暗比为14 h∶10 h，每天定时摇动3次。测定14 d后的蛋白核小球藻生物量，同时测定水质指标TP、TN浓度，筛选出优势菌种组合后继续进行试验，最终筛选出优势菌藻组合。

1.2.3 响应面优化试验

响应面法具有试验周期较短、回归方程精度高，可以探究多种因素间交互作用的影响等优点[13]，被广泛应用于微生物处理污水的条件优化，3D响应曲面可以直观获取响应面试验设计中的最优参数[14]。将选定的菌藻组合用于处理模拟尾水，采用响应面法中的Box-Behnken设计进行试验，优化菌藻共生系统对尾水中氮、磷去除效果试验的参数条件。

不同藻类物种的生长需要不同波长的光[15]，光波长（A）是研究微藻处理污水效果最重要的影响因素之一，用LED作为微藻光源，可更好地控制光和使用不同的波长[16]。向菌藻共生系统通气，可以提供氧气并保持一定的溶解氧浓度，促进菌藻与污水充分接触混合，通气量（B）影响污水处理的效果[17]。另外，合适的菌藻接种比能提升氮、磷的去除效果[18]。因此，选取了光波长、通气量、细菌接种量（C)作为需优化的响应参数。根据前期的单因素试验可知，TP在试验第1天去除效果最为明显，氨氮在前2 d去除效果较好，因此选择TP去除率、TN去除率、氨氮去除率以及1 d 的TP去除率、2 d 的氨氮去除率作为响应值，设置低、中、高3个水平，光波长分别为 450～465 nm（白光）、450～480 nm（蓝光）、615～650 nm（红光），通气量分别为 1、2、3 L/min，细菌接种量（以体积比计，全文同）分别为5%、10%、20%。以此建立3因素3水平试验（表1），探究响应参数对菌藻共生系统氮、磷去除效果的影响。共设置17组试验，每组设置3个平行。试验温度为25 ℃，光照强度为6 000 lx，光暗比为14 h∶10 h。

表1 响应面优化试验的因子及水平设计Table 1 Code and levels for testing variables of response surface methodology experiments

1.2.4 最优参数组合验证试验

为了检验响应面模型的合理性，将响应面优化试验得到的最优参数组合进行验证试验，设置3个平行试验，温度、光照强度、光暗比等环境条件与响应面优化试验相同，将得到的氮、磷去除率与响应面预测结果进行比较，以验证响应面模型预测结果的准确性。

1.3 指标检测与数据分析

水质指标测定：取水样经0.45 μm滤膜过滤后，测定水质指标TP、TN、氨氮浓度。参照《水和废水监测分析方法》，TP浓度采用钼锑抗分光光度法测定，TN浓度采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法测定，氨氮浓度采用水杨酸-次氯酸盐光度法测定。

采用扫描电子显微镜（scanning electron microcope，SEM）观察微藻表面以及细菌的附着情况。取适量菌藻混合样品，将样品经过清洗、固定、脱水、置换、干燥、黏样和镀膜后，将处理好的样品置于扫描电镜下进行观察。

使用Design expert 10软件对试验数据进行响应面优化分析。

2 结果与分析

2.1 优势菌藻组合筛选

不同菌种与蛋白核小球藻共培养14 d（此时藻生物量基本稳定）时对氮、磷的去除效果如图1所示。由图1可知，对照组C的TN、TP去除率分别为82.05%、90.82%，藻液的OD680为1.489。B3、B4的TN去除率分别为73.96%、71.81%，OD680分别为1.384、1.247，均低于对照组C。可见，枯草芽胞杆菌枯草亚种和水生异常球菌会在一定程度上抑制蛋白核小球藻的生长。B5组的TN、TP去除率和OD680与对照组接近，说明硝基还原假单胞菌对蛋白核小球藻的生长影响不大。B1、B2组的TN去除率分别为86.12%和87.74%，比对照组增加了4.96%和6.93%；TP去除率分别为94.45%和93.27%，比对照组增加了3.63%和2.45%；OD680分别为1.578、1.582，均高于对照组。可见，恶臭假单胞菌、地衣芽胞杆菌促进了蛋白核小球藻的生长，并且促进效果比较显著。

图1 不同菌藻共培养条件下的氮、磷去除效果Fig.1 Nitrogen and phosphorus removal effects under co-cultivation of different bacteria and microalgae

将以上2种优势菌种与蛋白核小球藻组合，组成藻-地衣芽胞杆菌共培养组、藻-恶臭假单胞菌共培养组、藻-两菌组（2种菌生物量之比为1∶1）3个试验组，对照组不变。由试验得出，藻-两菌组的TN、TP的去除率分别为87.39%、93.58%，藻液OD680为1.603，均高于其他2组。虽然藻-两菌组的TP去除率略低于藻-恶臭假单胞菌共培养组，但其微生物种类更多，系统相对更稳定。

2.2 响应面试验结果与优化

2.2.1 响应面试验结果

通过开展表1中的响应面试验，当TN、TP、氨氮去除率及1 d 的TP去除率、2 d的氨氮去除率（表2）分别作为响应值时，得到相应的响应面试验结果。接下来分别探究光波长、通气量、细菌接种量作为需优化的响应参数时对不同响应值的影响。

表2 响应面试验结果Table 2 Response surface methodology experimental results

2.2.2 响应面法对TN去除率的优化

2.2.2.1 TN去除率模型的方差分析

对表2的试验数据进行多元拟合分析，得到TN去除率的二次回归方程如下：

式中X1为TN去除率，%。

F为F检验统计量，表示拟合方程的显著程度。F越大，表示方程越显著，拟合程度越好。P为实际统计量计算出的显著性水平。当P＜0.05时，表示模型或因素影响显著；当P＞0.1时，表示影响不显著。回归方程的方差（ANOVA）分析结果见表3。由表3可知，TN去除率模型P为0.001 1，小于0.01，F为14.11，说明该回归模型显著，因此模型选择合适。模型的相关系数（R2）为0.927 4，说明预测值与试验值相关性较好。TN去除的AB交互项、BC交互项的P分别为0.011 3、0.031 6，F分别为 11.63、7.18，表明光波长和通气量、通气量和细菌接种量均存在显著的协同作用。因此，分别分析光波长和通气量、通气量和细菌接种量的交互作用对TN去除率的影响，探索优化TN去除率的条件。

表3 响应值为TN、2 d的氨氮、1 d的TP去除率的方差分析结果Table 3 Anova results of removal rate of TN, ammonia nitrogen after 2 days and TP after 1 days

2.2.2.2 光波长和通气量的交互作用对TN去除率的影响

不同细菌接种量条件下，光波长和通气量交互作用对TN去除率的影响如图2所示。由图2可知，当光波长一定时，TN去除率随着通气量先增大后减小，这说明通过向系统中通气，会减少菌藻的聚合和沉降，菌藻与污水中营养物质充分接触，加快微藻的生长速率，同时加快消耗氮、磷营养盐[19]，但是过量通气会导致剪向力过高，对微藻细胞造成损伤并增加能耗。

图2 不同细菌接种量条件下光波长和通气量对TN去除率的影响Fig.2 Effects of light wavelength and aeration rate on TN removal rate under different bacterial inoculation amount

由图2（a）可知，当细菌接种量为5%时，随着光波长的变化（从白光到蓝光再到红光），TN去除率逐渐增大。由图2（b）可知，当细菌接种量为10%，光波长为蓝光或红光时，TN去除率基本一致；光波长为白光时，TN去除率略低。这表明在蓝光或红光下生长的微藻往往表现出更高的生长率[20]，更易于吸收氮元素。由图2（c）可知，细菌接种量为20%时，光波长从白光到蓝光再到红光时，通气量与TN去除率成反比。当光波长为蓝光，通气量增加到1.8 L/min时，TN去除率最大达到93.7%；当光波长为红光，通气量为1.6 L/min时，TN去除率最大达到92.8%；当光波长为白光，通气量为2.2 L/min时，TN去除率最大可达92.4%。可见，在蓝光或红光下，菌藻共生系统更能有效去除氮且能耗较少，不同光波长下生长的蛋白核小球藻适宜的通气量有所差异。

2.2.2.3 细菌接种量和通气量的交互作用对TN去除率的影响

红光/蓝光条件下通气量和细菌接种量交互作用对TN去除率的影响如图3所示。由图3可见，当通气量一定时，细菌接种量较大的系统TN去除率较高。当通气量为1.0～2.0 L/min时，随着通气量增加，细菌接种量与TN去除率成正比；通气量为2.0～3.0 L/min时，细菌接种量对TN去除率的影响逐渐减弱，并从正比关系逐渐向抛物线的趋势变化。这表明通气量较小时，细菌接种量占主要影响因素，随着细菌接种量的增加，细菌会加快降解衰老的微藻细胞，将有机氮分解为无机氮，微藻同化吸收无机氮促进其生长，有效去除污水中的氮元素；随着通气量进一步增大，细菌接种量对TN去除率的影响效果略有下降，不同细菌接种量之间TN去除率差距较小。因此，当光波长为蓝光，通气量为2.0 L/min，细菌接种量为17.3%时，TN去除率最高可达93.9%；当光波长为红光，通气量为1.8 L/min，细菌接种量为15.9%时，TN去除率最高可达92.4%。由于光波长为蓝光，通气量为1.8 L/min，细菌接种量为20%时，TN去除率能达到93.7%，与通气量为2.0 L/min，细菌接种量为17.3%时的去除率（93.9%）非常接近，考虑到该条件下细菌接种量容易配制，且通气量较小，能耗较低，因此将光波长为蓝光，通气量为1.8 L/min，细菌接种量为20%确定为菌藻共生系统TN去除效果的最优条件。

1.1 临床资料 选择遂溪县人民医院自2016年7月—2018年5月通过收治的86例甲状腺良性结节患者为研究对象，患者均经超声引导下细针穿刺细胞学或粗针活检组织学检查确诊，且单侧甲状腺最大结节≤4 cm。其中49例接受超声引导下微波消融术治疗，视为实验组，女性29例，男性20例；年龄最小为26岁，最大为69岁，平均年龄为(41.45±7.32)岁。其余37例接受腹腔镜切除术，视为对照组；患者年龄最大为65岁，最小为19岁，平均年龄为(42.01±5.21)岁；女性患者20例，男性患者17例。两组的基本资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

图3 红光/蓝光条件下通气量和细菌接种量的交互作用对TN去除率的影响Fig.3 Effects of the interaction of aeration rate and bacterial inoculation amount on TN removal rate under red/blue light conditions

2.2.3 响应面法对氨氮去除率的优化

2.2.3.1 氨氮去除率模型的方差分析

对试验结果进行多元回归分析，得到2 d的氨氮去除率的二次回归方程如下：

式中X2为2 d的氨氮去除率，%。

氨氮去除率对应的响应面模型不具有显著相关性，但是反应2 d的氨氮去除率的模型拟合方程存在显著相关性（P=0.000 1＜0.05，F=59.80）（表 3），R2为0.987 2，说明实际值和预测值具有良好的相关性。氨氮可以被微藻直接吸收，试验第1、2天时微藻主要利用的氮源是氨氮，在试验后期，各试验组氨氮基本反应完全，此时氨氮去除率没有明显差距，因此选择2 d的氨氮去除率作为响应值。由于因素AC、BC交互项影响显著，对光波长和细菌接种量、通气量和细菌接种量的交互作用分别进行分析。

2.2.3.2 光波长和细菌接种量的交互作用对氨氮去除率的影响

在通气量为2.0 L/min的条件下，对光波长和细菌接种量的交互作用进行分析，其对氨氮去除效果如图4所示。由图4可知，当通气量一定时，在细菌接种量较低的条件下，2 d的氨氮去除效果较好，原因可能是当细菌占比变大时，细菌更快地把衰老的微藻细胞或碎屑分解为无机氮，增加了污水中的氨氮含量。当光波长不同时，2 d的氨氮去除效果也会受到影响。当光波长为红光，细菌接种量为10%时，氨氮去除率约为98.8%，氨氮基本上完全被去除；当光波长为蓝光，细菌接种量为5%时，氨氮去除率为98.4%。光波长为红光或者蓝光时，氨氮在短期内（2 d）的去除效果较好。

图4 光波长和细菌接种量的交互作用对2 d氨氮去除率的影响Fig.4 Effect of the interaction of light wavelength and bacterial inoculation amount on ammonia nitrogen removal after 2 days

2.2.3.3 通气量和细菌接种量的交互作用对氨氮去除率的影响

在蓝光/红光条件下，通气量和细菌接种量的交互作用对氨氮的去除效果如图5所示。由图5（a）可知，当光波长为蓝光时，随着通气量增大，2 d的氨氮去除率呈先上升后下降的趋势；随着细菌接种量增大，2 d的氨氮去除率逐渐减小。因此，当通气量为2 L/min，细菌接种量为5%时，2 d的氨氮去除率最大为98.4%。由图5（b）可知，在光波长为红光，通气量较小时，随着细菌接种量增大，短期内氨氮去除率逐渐减小。当通气量为2～3 L/min，细菌接种量超过10%时，氨氮基本上完全被去除。

图5 红光/蓝光条件下通气量和细菌接种量的交互作用对2 d氨氮去除率的影响Fig.5 Effect of the interaction of aeration rate and bacterial inoculation amount on ammonia nitrogen removal after 2 days under red/blue light conditions

2.2.4 响应面法对TP去除率的优化分析

2.2.4.1 TP去除率模型的方差分析

对试验结果进行多元回归分析，得到TP在1 d时去除率的二次回归方程如下：

式中X3为1 d的TN去除率，%。

菌藻共生系统的TP去除率响应面模型的P为0.236 4，表明该模型影响不显著。但可以看出，各组试验后期的TP去除率基本一致，均在97%以上。反应1 d的TP去除率的响应面模型拟合方程存在显著相关性（P=0.000 3＜0.05，F=21.20）（表 3），R2为0.964 6，说明回归方程拟合程度很好。在1 d的TP去除率的回归模型中，因素AC交互项影响显著，因而对光波长和细菌接种量间的交互作用进行分析。

2.2.4.2 光波长和细菌接种量的交互作用对TP去除率的影响

当通气量为2 L/min 时，光波长和细菌接种量间交互作用对TP去除效果的影响如图6所示。由图6可知，当通气量为2 L/min时，光波长为蓝光时，1 d的TP去除率随着细菌接种量的增加而增大。当细菌接种量增加到15%时，TP去除率已达到95%；当细菌接种量增加到20%时，污水中的磷元素已基本消耗完全。这是由于蓝光倾向于促进基因转录和增强活化酶的调节，从而提升了在蓝光培养下微藻的生长速率[15]，同时恶臭假单胞菌具有好氧吸磷的作用[21]，地衣芽孢杆菌释放胞外物质，促进了微藻叶绿素相关基因的表达[22]，从而促进微藻生长和对磷元素的吸收。当光波长为红光时，可以促进微藻在营养物质浓度较低的情况下达到较高生长率[23]，1 d的TP去除率较为稳定，为86.2%～88.6%。

图6 光波长和细菌接种量交互作用对1 d的TP去除效果的影响Fig.6 Effect of the interaction of light wavelength and bacterial inoculation amount on TP removal after 1 day

综上，当通气量为2 L/min，光波长为蓝光，细菌接种量增加到20% 时，1 d的TP去除率可达到100%。前面已得出TN去除率的最优操作参数是光波长为蓝光，通气量为1.8 L/min，细菌接种量为20%，在此条件下1 d的TP去除率也可达到100%。

2.3 响应面模型验证

由上述响应面试验分析得到，当光波长为蓝光，通气量为1.8 L/min，细菌接种量为20%时，预测TN去除率为93.7%，1d的 TP去除率最高可达到100%，虽然2 d的氨氮去除率为83.2%，但第5天氨氮的去除率已达到98.3%。综合考虑对模拟尾水中氮、磷的去除效果，选择此参数组合作为最优参数条件进行验证试验。试验经过5 d后，得到TN、1 d的TP、2 d的氨氮、总氨氮的去除率分别为93.25%、95.16%、85.62%、97.78%，实际值与响应面模型预测值接近，证明了预测结果的准确性。另外，菌藻系统出水TN、TP、氨氮浓度符合GB 3838—2002 中Ⅴ类水质标准。

2.4 菌藻共生系统扫描电镜表征

菌藻共生系统处理模拟污水5 d后，取处理后的菌藻液，通过SEM观察菌藻共生情况（图7），包括细菌附着在蛋白核小球藻表面上〔图7（a）〕和微藻的胞外聚合物围绕在细菌周围的情况〔图7（b）〕。这种菌藻共生情况有利于氮、磷等营养物质和气体的交换，促进营养物质的循环和微藻同化吸收，同时由于细菌分泌的信号分子可以激活或抑制基因表达，影响微藻生长和代谢变化[24]，这种共生情况有利于菌藻间的信号交换。

图7 培养5 d后菌藻共生情况SEM图Fig.7 SEM diagram of symbiosis of bacteria and algae after 5 day's culture

3 结论

（1）将蛋白核小球藻与不同菌种分别共培养，筛选得到蛋白核小球藻、地衣芽孢杆菌和恶臭假单胞菌共培养的优势菌藻组合。将优势菌藻组合采用响应面法进行试验，TN、TP和氨氮去除率等指标达到最优效果时，其最优参数不尽相同。光波长为蓝光，通气量为1.8 L/min，细菌接种量为20%是TN的最优去除条件，此时TN去除率为93.7%，1 d的TP去除率可达100%。当光波长为蓝光、通气量为2.0 L/min、细菌接种量为5%时，2 d的氨氮去除率最大达到98.4%；当光波长为红光、通气量为2.0～3.0 L/min、细菌接种量超过10%时，2 d后氨氮基本上完全被去除。

（2）综合考虑菌藻共生系统对氮、磷的去除效果，最优参数条件为光波长为蓝光，通气量为1.8 L/min，细菌接种量为20%。通过验证试验证明了预测结果的准确性，菌藻共生系统出水氨氮、TN和TP浓度达到GB 3838—2002 中Ⅴ类水质的排放标准。

（3）扫描电镜结果显示，菌藻共生系统中，细菌附着在微藻表面和微藻的胞外聚合物围绕在细菌周围，这种共生关系有利于菌藻之间的物质交换。