黄云先 刘云怀 杨光荣

丽江市食品药品检验所,云南 丽江 674100

丽江山慈菇是百合科植物山慈菇IphigeniaindicaKunth的鳞茎[1]，又名山慈菇、土贝母、草贝母、假贝母、闹狗药[2]、苦子、光苦子、益辟坚[3]、光慈菇[4]如图1所示。云南省地方习用药材，为纳西族、白族、彝族常用药材。载于《本草遗拾》，为《云南省药品标准》(1974年版、1996年版)、《云南省中药材标准》2005年版第二册·彝族药收载品种。与《中国药典》2015年版一部收载“山慈菇”比较，来源系不同科属植物，为与国家标准相区别，谓之“丽江山慈菇”，是云南产中成药的“乳癖清胶囊(国药准字Z20025068)”的原料药之一。丽江山慈菇还是提制秋水仙碱的主要原料。《云南省中药材标准》2005年版第二册·彝族药中对丽江山慈菇的性状、鉴别、水分、酸不溶性灰分、浸出物有明确规定，但对其含量却没有测定方法，本文参照文献[5-6]，通过对云南省丽江古城区和玉龙县及大理4个批次的丽江山慈菇样品进行了秋水仙碱的含量测定，以建立一个合理的测定方法，从而达到控制丽江山慈菇药材质量的目的。

A.地上部分 B.球茎图1 丽江山慈菇图

1 仪器与试药

安捷伦1260型高效液相色谱仪[二极管阵列检测器，安捷伦(中国)科技有限公司]； Hubble C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm,OmniGene LLC)；BT224S电子分析天平(德国塞多利斯)； MS205DU电子分析天平(梅特勒Pur)； elab Flex 超纯水机(英国ELGE)。

秋水仙碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：101176-201202，按93.6%计)；乙腈、甲醇[色谱纯，美国塞默飞世尔科技(中国)有限公司]； 磷酸(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)；水(实验室自制UP水，Ω=18.3)。丽江山慈菇样品购买、采集丽江古城区、玉龙县及大理样品共4个：L01，2015年8月，采自丽江市玉龙县龙蟠乡新文村，野生品，干燥花期全株；L02，2015年9月，采自丽江市古城区金山乡东河村，野生品，干燥果期全株；L03，2015年9月，购自丽江市古城区象山市场，为大理州鹤庆县野生品，干燥药材球茎；L04，2015年10月，购自丽江市玉龙县龙蟠乡新文村药农严四军，为其采挖的当地野生品，干燥药材球茎。

2 方法与结果

2.1 色谱柱与系统适用性试验 谱柱：Hubble C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-水(60∶40)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，进样量为10 μL，检测波长为254 nm，柱温为30 ℃。理论板数按丽江山慈菇峰计不低于3000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取秋水仙碱对照品适量，加甲醇稀释至刻度，制成每1 mL含26.133 μg的溶液，作为对照品液。色谱图如图2所示。

秋水仙碱对照品图2 秋水仙碱对照品HPLC色谱图

2.2.2 供试品溶液 取丽江山慈菇粉末(过四号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，称定重量。超声(500 W，40kHz)处理30 min，放冷，再次称定重量，用50%甲醇补足减失重量。滤过，滤液作为样品溶液。如图3所示。

秋水仙碱图3 丽江山慈菇供试品HPLC色谱图

2.3 线性关系 取秋水仙碱对照品13.96 mg，精密称定，加甲醇制成每1 mL含26.133、52.266、104.530、156.800、209.060、261.330、522.660 μg的一系列的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定其峰面积，以对照品的浓度(X,μg·mL-1)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，按外标法进行线性回归，线性方程为Y=42.65537X-149.68159，r=0.999 7。说明秋水仙碱在26.133～522.660 μg·mL-1浓度范围内线性良好。

2.4 精密度试验 取26.133 μg·mL-1秋水仙碱对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下，重复进样6次，测定其峰面积的RSD为0.3%(n=6)，表明该系统的精密度良好。

2.5 重复性试验 取供试品溶液L01-1，按上述方法连续测定8次，测得峰面积RSD为0.6%(n=8)，表明供试品溶液重复性较好。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液L01-1，按含量测定方法测定9次，每次间隔约8 h，测得峰面积的RSD为1.1%(n=9)，表明供试品溶液在72 h内稳定。

2.7 回收率试验 精密量取线性关系考察中储备液1 mL至10 mL量瓶中、3 mL至25 mL量瓶中1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成含33.480、40.176、50.220 μg·mL-1的对照品溶液。分别取以上3个浓度秋水仙碱对照品以1∶1的比例加入已知含量L01-1、L01-2、L01-3中，按前述色谱条件测定。回收率分别为96.7%，99.8%，102.3%，98.4%，98.7%，100.5%，99.3%，103.9%，99.6%，RSD=2.1%(n=9)。

2.8 样品含量测定 取26.133 μg·mL-1的秋水仙碱对照品及各样品按“2.2.2”方法制备的供试品溶液，进行测定，按外标法计算丽江山慈菇中秋水仙碱的含量。同一样品平行测定2次，结果见表1。

表1 丽江山慈菇含量测定结果 (n=2)

3 讨论

3.1 检测波长的选定 以二极管阵列检测器进行全波长190～400 nm扫描，秋水仙碱对照品在254 nm、353 nm处有最大吸收，经试验确定采用254 nm作为检测波长。理论板数按秋水仙碱峰计算不低于3000。

3.2 流动相的选择 筛选了乙腈-甲醇(40∶60)、甲醇-水(55∶45)(60∶40)(65∶35)、甲醇-0.2%磷酸溶液(60∶40)(40∶60)六组流动相进行考察，结果甲醇-水(60:40)分离效果好，峰形良好，且保留时间适中，故确定上述流动相系统为本法的流动相。

3.3 样品提取溶剂选择 取本品粉末(过四号筛)0.5 g或1 g，筛选了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇超声(500 W，40 kHz)处理30 min、1 h、2 h或加热回流30 min的方法分别进行样品提取，通过考察，取样品0.5 g与1 g，样品1 g峰面积较好且稳定；加热回流30 min与超声(500 W，40 kHz)处理30 min结果相差不大；提取时间30 min与1 h、2 h后，提取率几乎不变；使用50%的甲醇超声处理30 min提取效率最高。故确定样品提取方法为取本品粉末(过四号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，称定重量。超声(500 W，40 kHz)处理30 min，放冷，再次称定重量，用50%甲醇补足减失重量。滤过，滤液作为供试品溶液。此方法提取效率最高，且操作简便。

4 结论

不同地区丽江山慈菇谱图略有不同，但秋水仙碱确实都存在，可见以秋水仙碱作为丽江山慈菇药材标识性成分有其合理性。且本法简便、快捷，准确度高，专属性强，重复性好，填补了以往丽江山慈菇含量测定的空白，可用于丽江山慈菇药材的含量测定及质量控制。经试验验证，新拟HPLC法可行。按实际测得含量值，建议定丽江山慈菇按干燥品计，含秋水仙碱(C22H25NO6)不得少于0.12%。