非编码RNA 在宫颈癌组织中的表达及临床意义

2022-07-30郭方圆李文亮魏向群

昆明医科大学学报 2022年5期

郭方圆，李文亮，徐凡，魏向群

（1）云南大学附属医院妇科，云南昆明 650021；2）昆明医科大学第三附属医院妇瘤科，云南昆明 650118）

宫颈癌（cervical cancer，CC）是妇科常见的恶性肿瘤。根据国际癌症研究署2020 年全球癌症统计数据表明，在女性恶性肿瘤中，子宫颈癌发病率和死亡率居全球女性癌症第四位，其全球新发病例大约有60.4 万[1]，仅中国子宫颈癌新发病例数就有10.97 万例[2]，占全球宫颈癌新发病例的18.1%。严重威胁着女性的健康及生命。虽然随着宫颈癌疫苗及宫颈癌筛查的普及，宫颈癌晚期检出率在逐年下降，但不发达国家宫颈癌的3～5 a 生存率不高于50%[3]。因此，寻找合适的分子标志物用于宫颈癌的早期诊断及治疗极为重要。

lncRNA 为长度大于200 个核苷酸，且不编码蛋白质的转录物。在宫颈癌发生发展机制研究中，lncRNA 发挥的作用，包括早期肿瘤标志物检测[4]、肿瘤发生发展过程中增殖和凋亡能力改变[5]、化药耐药[6]和放射性抵抗[7]等日益凸显，为临床早期诊断、治疗和预后评估奠定了理论基础。人类LINC00982 基因是位于染色体1p36.32 上的一个非编码 RNA，通过NCBI 数据库检索显示LINC00982有2 个剪切体，剪切体1 为3 722 bp，剪切体2为658 bp。目前关于LINC00982 的研究较少，现有的报道证实其在胃癌、肺腺癌及肾癌等恶性肿瘤中呈现低表达状态，扮演着类似抑癌基因的作用，通过诱导细胞凋亡，从而抑制癌细胞增殖和肿瘤生长。但目前尚无LINC00982 在宫颈癌方面的相关报道。miRNA 是一类长约22 个核苷酸的非编码RNA，可通过完全或者不完全互补的方式结合到靶基因的3’-UTR（非编码区），从而起到降解或者抑制靶基因翻译的作用，从而调节细胞的分化、生长、凋亡和增殖。miRNA 可通过多种信号途径参与多种实体肿瘤细胞的增殖、侵袭、黏附、转移以及凋亡，而且与放疗、化疗、靶向治疗等密切相关。hsa-miR-1246 是被具有抗癌活性的 P53 所调控的一个新的 miRNA，定位于人胞核染色体2q31.1。hsa-miR-1246 调控着癌细胞的增殖、分化、凋亡、衰老及转移入侵，在包括宫颈癌在内的多种肿瘤的诊断、靶基因治疗和判断预后方面发挥着重要作用。相关研究表明，hsa-miR-1246 可促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移[6]。

1 资料与方法

1.1 资料来源

选取云南大学附属医院妇科2021 年1 月至2021 年10 月经子宫颈活检确诊为子宫颈癌的患者样本43 例（根据2019 年FIGO 分期标准，Ⅰ期15 例、Ⅱ期13 例、Ⅲ期11 例、Ⅳ期4 例，其中宫颈鳞癌38 例、腺癌5 例；低中分化30 例，高分化13 例），患者年龄（56.57±8.04）岁。同时选取同期因子宫肌瘤等良性疾病行全子宫切除后病理确诊为正常宫颈样本21 例作为对照组，患者年龄（44.70±3.99）岁。宫颈癌患者入组标准：（1）病理确诊为宫颈癌，且根据国际妇产科联合会（FIGO）2019 分期标准进行分期；（2）所有宫颈癌患者取材前未接受放化疗，免疫治疗；（3）临床资料齐全。正常宫颈组纳入标准：（1）因其他良险疾病行子宫全切的患者；（2）HPV 检测为阴性；（3）病理证实为正常宫颈组织。排除标准：除外其他恶性肿瘤、血液病及凝血功能障碍者。采集以上患者标本均签署知情同意书，研究方案经云南大学附属医院医学伦理委员会同意（伦理审查编号2021044）。

1.2 试剂及材料

Trizol Reagent 购自美国MRC 公司、RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit 购自Thermo Scientific™公司、All-in-One™ qPCR Mix及All-in-One™ miRNA qRT-PCR Detection Kit 购自GeneCopoeia™公司、lncRNA 及microRNA 引物由GeneCopoeia™合成，见表1。

表1 实时荧光定量PCR 引物序列Tab.1 The sequence of RT-PCR primers

1.3 Total RNA 提取

取液氮保存的组织标本，在液氮中碾碎至粉状，按照100 mg 左右组织加入1 mL Trizol，震荡后静置5 min，加入200 µL 氯仿，震荡数分钟后静置5 min，12 500 r/min、4℃、离心15 min。离心后将上层水相吸出400 µL，震荡混匀后静置数分钟，12 500 r/min，4℃、离心15 min。弃上清，加入1 mL 无水乙醇，7 500 r/min，4℃、离心5 min，弃上清，洗涤2 次。适度干燥，加入50 µL 去酶水反复吹打数次，使其充分溶解待用。

1.4 Real-time PCR 检测

对提取的总RNA 进行反转录获得cDNA，采用SYBR Green 法进行RT-qPCR 验证，分别以GAPDH、U6 为内参基因。RT-qPCR 反应体系为20 µL：Water 7.0 µL、Primer 2.0 µL、cDNA 1.0 µL、2×PCR Master Mix 10.0 µL。反应条件为：95℃、10 min；（95℃、10 s，60℃、20 s，72℃、10 s）×40 cycles；（65℃、60 s，95℃、15 s）；30℃、30 s。RT-qPCR 检测中每孔均设3 个复孔，取平均Ct值作为该样本的最终Ct 值。分别以GAPDH、U6为内参基因，以2-△△Ct 值作为LINC00982 及miR-1246 的相对表达水平。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 正常子宫颈和子宫颈癌组织中LINC00982-1/2（LINC00982 转录形成2 个剪切体，剪切体1 及剪切体2）及hsa-miR-1 246 的表达变化

如表2 所示，与正常子宫颈组织相比，人子宫颈癌组织中LINC00982-1/2 的表达下调（P＜0.05），见图1；而hsa-miR-1 246 表达上调（P＜0.05），见图2。

图1 LINC00982 剪切体1 及LINC00982 剪切体2 在正常子宫颈及子宫颈癌组织中的表达情况Fig.1 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2in normal cervical and cervical carcinoma

图2 hsa-miR-1 246 在正常宫颈及子宫颈癌组织中的表达情况Fig.2 expression of hsa-miR-1 246 in normal cervical and cervical carcinoma

表2 LINC00982、hsa-miR-1246 表达量（）Tab.2 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

与正常宫颈组比较，*P＜0.05。

2.2 正常子宫颈及子宫颈癌组织不同分化程度（病检确定分化程度）中LINC00982-1/2、hsa-miR-1246 的表达变化

如表3 所示，与正常子宫颈组织相比，中低分化及高分化宫颈癌组织中LINC00982-1/2 的表达均下调（P＜0.05），且高分化宫颈癌组织中的表达量低于中低分化宫颈癌组织（P＜0.05），见图3；与正常子宫颈组织相比，中低分化及高分化宫颈癌组织中hsa-miR-1 246 表达均上调（P＜0.05），且高分化宫颈癌组织中的表达量低于中低分化宫颈癌组织（P＜0.05），见图4。

图3 LINC00982 剪切体1 和LINC00982 剪切体2 在人正常宫颈及不同分化程度的宫颈癌组织中的表达变化Fig.3 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2 in normal cervical and cervical cancer tissues with different degrees of differentiation

图4 hsa-miR-1246 在人正常宫颈及不同分化程度的宫颈癌组织中的表达变化Fig.4 Expression of hsa-miR-1246 in normal cervical and cervical cancer tissues with different degrees of differentiation.

表3 LINC00982、hsa-miR-1246 表达量（）Tab.3 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

与正常宫颈组比较，*P＜0.05；与低、中分化组比较，#P＜0.05。

2.3 正常子宫颈及子宫颈癌组织不同分期（以2019 年FIGO 分期为标准）中LINC00982-1/2、hsa-miR-1 246 的表达变化

如表4 所示，Ⅲ/Ⅳ期人宫颈癌组织中LINC 00982-1/2 的表达高于Ⅰ/Ⅱ期人宫颈癌组织（P＜0.05），Ⅰ/Ⅱ期人宫颈癌组织中LINC00982-1/2的表达均低于正常宫颈组织，而Ⅲ/Ⅳ期中LINC00982-1 的表达量高于正常子宫颈组织，LINC00982-2 的表达量则低于正常子宫颈组织，见图5；Ⅲ/Ⅳ期人宫颈癌组织中hsa-miR-1246的表达高于Ⅰ/Ⅱ期人宫颈癌组织，且Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期人宫颈癌组织中hsa-miR-1246 的表达均高于正常人宫颈组织（P＜0.05），见图6。

图5 LINC00982 剪切体1 和LINC00982 剪切体2 在人正常宫颈及不同分期的宫颈癌组织中的表达变化Fig.5 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2 in normal cervix and cervical cancer tissues of different stages

图6 hsa-miR-1246 在人正常宫颈及不同分期的宫颈癌组织中的表达变化Fig.6 Expression of hsa-miR-1246 in normal cervix and cervical cancer tissues of different stages.

表4 LINC00982、hsa-miR-1246 表达量（）Tab.4 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

与正常宫颈组比较，*P＜0.05；与Ⅰ/Ⅱ期比较，#P＜0.05。

2.4 正常子宫颈及子宫颈癌组织不同病理类型中LINC00982-1/2、hsa-miR-1 246 的表达变化

如表5 所示，与正常人宫颈组织相比，人宫颈鳞状细胞癌（SSC）及腺癌（ADS）中LINC00982-1/2 的表达均下调，具有显著性差异（P＜0.05），且腺癌中LINC00982-1 的表达量低于鳞状细胞癌（P＜0.05），腺癌中LINC00982-2 的表达量则高于鳞状细胞癌，但两者间无统计学意义（P＞0.05），见图7；与正常人宫颈组织相比，人宫颈鳞状细胞癌及腺癌中hsa-miR-1246 的表达均上调，具有显著性差异（P＜0.05），且腺癌中hsa-miR-1246 的表达量高于鳞状细胞癌（P＜0.05），见图8。

图7 LINC00982 剪切体1 和剪切体2 在正常子宫颈及子宫颈癌组织不同病理类型中的表达变化Fig.7 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2 in different pathological types of normal cervix and cervical cancer tissues.

图8 hsa-miR-1246 在正常子宫颈及子宫颈癌组织不同病理类型中的表达变化Fig.8 expression of hsa-miR-1246 in different pathological types of normal cervix and cervical cancer tissues.

表5 LINC00982、hsa-miR-1246 表达量（）Tab.5 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

与正常宫颈组比较，*P＜0.05；与鳞状细胞癌组比较，#P＜0.05。

2.5 正常人子宫颈及子宫颈癌组织不同SCCA 表达量（＜1.5 ng/mL 和≥1.5 ng/mL）中LINC00982-1/2、hsa-miR-1246 的表达变化

如表6 所示，与正常人宫颈组织相比，在人宫颈癌组织SCCA（＜1.5 ng/mL）及SCCA（≥1.5 ng/mL）中LINC00982-1/2 的表达均下调（P＜0.05），且随SCCA 的增高，LINC00982-1/2 的表达量降低，见图9；而hsa-miR-1246 表达上调（P＜0.05），且随SCCA 的增高，其表达量增高，见图10。

图9 LINC00982 剪切体1 和LINC00982 剪切体2 在正常人子宫颈及子宫颈癌组织不同SCCA 表达量Fig.9 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2 in normal cervix and cervical cancer tissues with different SCCA levels

图10 hsa-miR-1246 在正常人子宫颈及子宫颈癌组织不同SCCA 表达量Fig.10 Expression of hsa-miR-1246 in normal cervix and cervical cancer tissues with different SCCA levels

表6 LINC00982、has-miR-1246 表达量（）Tab.6 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

与正常宫颈组比较，*P＜0.05；与SCCA（＜1.5 ng/mL）组比较，#P＜0.05。

2.6 正常人子宫颈及子宫颈癌不同肿瘤大小中LINC00982-1/2、hsa-miR-1246 的表达变化

如表7 所示，与正常人宫颈组织相比，肿瘤直径≤4 cm 及肿瘤直径＞4 cm 的组织中，LINC00982-1/2 的表达均下调，具有显著性差异（P＜0.05），肿瘤直径＞4 cm 的组织中，LINC00982-1/2 的表达高于肿瘤直径≤4 cm 者，见图11；与正常人宫颈组织相比，肿瘤直径≤4 cm 及肿瘤直径＞4 cm 的组织中，hsa-miR-1246 的表达均上调，具有显著性差异（P＜0.05），肿瘤直径＞4 cm 的组织中，hsa-miR-1246 的表达高于肿瘤直径≤4 cm 者，见图12。

图11 LINC00982 剪切体1 和LINC00982 剪切体2 在正常人子宫颈及子宫颈癌不同肿瘤大小中的表达变化Fig.11 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2 in the normal cervix and different tumor sizes of cervical cancer

图12 hsa-miR-1246 在正常人子宫颈及子宫颈癌不同肿瘤大小中的表达变化Fig.12 Expression of hsa-miR-1246 in the normal cervix and different tumor sizes of cervical cancer.

表7 LINC00982、has-miR-1246 表达量（）Tab.7 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

与正常宫颈组比较，*P＜0.05；与≤4 cm颈肿瘤组织组比较，#P＜0.05。

3 讨论

3.1 LINC00982 在宫颈癌组织中的表达及临床意义

lncRNA 作为非编码RNA，其二级结构与蛋白质和染色质相互作用，使其具有广泛功能。大量通过检测lncRNA 的表达水平差异，来判断其与宫颈癌的关联。人类LINC00982 基因是一个长的基因间非编码RNA。对其相关研究较少。目前对其相关机制研究表明，LINC00982 可以通过调节P15 和P16 蛋白的表达来部分抑制癌细胞的增殖并阻止细胞周期[8]，同时LINC00982 还可以通过PI3K-ATK 信号通路，诱导细胞凋亡[9-10]，扮演着类似抑癌基因的作用。但尚未见LINC00982在宫颈癌中的相关报道。

本研究发现，与正常子宫颈组织相比，子宫颈癌组织中LINC00982-1/2 的表达下调，提示LINC00982 可能在宫颈癌组织中发挥抑癌基因的作用。且LINC00982 的表达与宫颈癌组织的分化程度、临床分期、病理类型、SCCA 的高低、肿瘤直径密切相关。宫颈癌组织中LINC00982 的表达量随SCCA 的增高而降低，进一步表明LINC00982 的表达可能与肿瘤负荷相关，提示其可能扮演着类似抑癌基因的角色。但患者临床分期越晚、肿瘤直径越大、分化程度越低，宫颈癌组织中LINC00982 的表达量越高，似乎又与其抑癌基因的功能相悖，这一现象的出现一方面可能与临床样本的检测会受到多种干扰因素影响相关。另一方面，可能与实验样本中晚期样本数量偏少有关（Ⅳ期患者仅4 例），需要后期扩大实验样本量进行验证，或进一步通过细胞实验进行肿瘤细胞表型分析验证。腺癌中LINC00982-1 的表达量低于鳞状细胞癌，但腺癌与鳞状细胞癌中LINC00982-2 两者比较差异无统计学意义，虽然两者间无统计学意义，但导致这种差异的原因是否与LINC00982 不同剪接体间的功能不同有关，仍有待后续进一步深入研究。

3.2 hsa-miR-1 246 在宫颈癌组织中的表达及临床意义

目前，人体内已发现的miRNA 有2000 多种，占人类基因组的1%，调控着 30%基因的表达[11]。部分肿瘤相关 miRNA 负载量的高低可作为患者预后的独立危险因素，从而可预测肿瘤的发生及治疗效果[12]。研究表明，子宫颈癌患者血清样品[13]、癌组织[14]中 miR-1246 呈高表达，同时，宫颈鳞癌患者血清中 hsa-miR-1246 含量明显高于宫颈上皮内瘤变患者及健康体检妇女，且 hsa-miR-1246 的高表达与宫颈鳞癌患者 FIGO 分期、肿瘤大小、淋巴结转移、脉管浸润密切相关[15]。

本研究发现，与正常子宫颈组织相比，子宫颈癌组织中hsa-miR-1246 高表达，提示hsa-miR-1246 可能在宫颈癌组织中发挥癌基因的作用。且hsa-miR-1246 的表达与宫颈癌组织的分化程度、临床分期、SCCA 的高低、肿瘤直径密切相关。患者临床分期越晚、肿瘤直径越大、SCCA 表达量越高、分化越低，hsa-miR-1246 的表达量越高，进一步表明hsa-miR-1246 可能促进肿瘤的发生与发展，与患者预后不良密切相关。且hsa-miR-1246 的表达与病理类型密切相关，在腺癌中的表达量明显高于鳞状细胞癌。

本文首次报道了宫颈癌相关的一种LncRNA（LINC00982），该 LncRNA 在宫颈癌组织中表达下调，提示其可能参与宫颈癌的发生与发展，为宫颈癌的诊断提供新的生物标志物及治疗提供潜在而有效的靶点。同时我们发现，hsa-miR-1246在子宫颈癌组织中高表达，且hsa-miR-1246 的表达与宫颈癌组织的分化程度、临床分期、SCCA 的高低、肿瘤直径密切相关，表明hsa-miR-1246 可能作为癌基因，参与肿瘤的发生与发展。此外，LINC00982 与miR-1246 的表达呈负相关，表明LINC00982 可能通过靶向hsa-miR-1246 参与肿瘤的发生、发展过程，其机制有待进一步深入研究。