梁桂丽 ，李灿美 ，邢成锋 ，董运龙 ，王 娟 ，雷 梓 ，缪应雷 ，兰丹凤

（1）昆明医科大学第一附属医院消化内科，云南省消化系统疾病临床医学研究中心，云南 昆明 650032;2）大理白族自治州人民医院肿瘤科，云南 大理 671000;3）昆明医科大学第一附属医院检验科;4）病理科，云南 昆明 650032）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种主要累及结肠的慢性特发性肠道炎症性疾病，是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD） 的主要类型，以反复发作的腹痛、腹泻和粘液脓血便为常见的临床症状，可导致严重的并发症，增加肠癌风险甚至威胁生命[1]。全世界将近500 万人受IBD 困扰，既往IBD 在欧美国家多见，亚非国家少见，近些年来IBD 的发病率较前明显升高，尤其在发展中国家[2]。尽管IBD 的发病机制尚未完全明确，多数学者认为它是由多种因素相互作用所致，与遗传易感者在环境、精神因素作用和肠道菌群的参与下免疫应答失调有关[3]。近年来研究发现鸟苷酸环化酶C（guanylate cyclase C，GCC）信号转导通路调节肠上皮屏障功能和肠道炎症的发生。GC-C 是一种主要表达于肠上皮细胞的跨膜受体，其内源性配体是鸟苷蛋白（guanylin，Gn）和尿鸟苷素（uroguanylin，Ugn），亦表达于胃肠道上皮细胞[4]。当配体（Gn/Ugn）与GC-C 结合后，刺激细胞内三磷酸鸟苷（GTP）转换为环磷酸鸟苷（cGMP），cGMP 水平增高可促进氯离子分泌，抑制钠离子吸收，导致水和离子分泌至肠腔，参与维持细胞内外正常的离子浓度和肠道水电解质平衡[5]。

本课题前期研究发现，活化的GC-C 信号通路可保护肠上皮细胞与肠上皮内淋巴细胞的肠黏膜免疫屏障，GC-C 配体可能成为UC 潜在的治疗靶点[6]。动物实验研究发现，结肠炎小鼠在注射Gn 过表达慢病毒载体后精神、进食及活动好转，肠道通透性降低，稀便、粘液血便和结肠组织炎症明显减轻，外周血炎症相关因子水平显著降低[7]。然 而，GC-C 基因敲除（GC-C-/-）小鼠在DSS 诱导下肠道炎症反应的变化尚不清楚。因此，本研究运用GC-C-/-小鼠，探索其在化学物质作用下与野生型小鼠相比肠道炎症损伤的差异，为寻求IBD 新的治疗策略提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂

6～8 周龄的GC-C 基因敲除（GC-C-/-）小鼠和野生型（WT）小鼠，体重18～22g，雄性，在江苏集萃药康生物科技有限公司完成GC-C 基因敲除小鼠的构建和鉴定实验（许可证号：SCXK（苏）2018-0008，动物批号：GFW01202003804）。GCC-/-小鼠制作和鉴定策略见图1。GC-C-/-小鼠构建：根据NCBI 编号选取转录本201（ENSMUST000 00032338.9）进行基因编辑。用CRISPR/Cas9 系统制作GC-C 基因敲除小鼠。把转录得到的sgRNA和cas9 混合并调整注射浓度，用显微注射仪将其注射入Balb/c 小鼠受精卵中，将1-3 外显子确定为切割位点，然后将受精卵移植到Balb/c 伪孕雌性小鼠的子宫内，等待F0 代出生。GC-C-/-小鼠鉴定：剪取尾组织，用酚氯仿法直接提取DNA，在靶区域内设计合成引物并鉴定，选取PCR 阳性样品进行测序，引物购买自生工生物工程（上海）股份有限公司，鉴定凝胶电泳图如图2。右旋糖酐硫酸酯钠（DSS），批号：S3045，货号：160110，由MP Biomedicals 生物医学公司生产。GCC（#HQP008552）引物由广州复能公司（GeneCopoeia）合成。抗体rabbit polyclonal anti-GC-C（Abcam，货号：ab225864），稀释度：1∶1 000；通用二抗anti-rabbit IgG（CST，货号：7074），稀释度：1∶2 000。

图1 GC-C 基因敲除小鼠制作和鉴定策略图Fig.1 The production and identification strategy of GC-C knockout mice

图2 GC-C 基因敲除小鼠鉴定电泳图Fig.2 The identification electrophoretogram of GC-C knockout mice

1.2 实验动物分组

将48 只小鼠随机分组，12 只/组，共4 组。具体分组及实验操作过程如下：（1）WT 小鼠对照组（Control）和GC-C-/-小鼠对照组（GC-C-/-）：均予以正常自由饮水、正常饲养；（2）WT 小鼠结肠炎组（WT+DSS）和GC-C-/-小鼠结肠炎组（GC-C-/-+DSS）：把DSS 混溶于蒸馏水并按配比调制成3%（W/V）的水溶液，小鼠每日自由饮用，共7 d，均不需另予饮水。本实验已通过昆明医科大学医学伦理委员会审批。

1.3 疾病活动指数（DAI）评分

从实验第 1 日起，每日称量小鼠体重，观察大便性状如有无稀便，有无潜血（联苯胺法测定）及肉眼血便并进行DAI 评分（评分标准见表1）[8]。DAI 评分=（体重评分+大便性状评分+出血评分）/3。

表1 DAI 评分标准Tab.1 DAI scoring criteria

1.4 实验组织取材

实验第8 日，称量小鼠体重并收集粪便样本后，使用10%水合氯醛2 mL 腹腔内注射进行小鼠麻醉，在麻醉状态下通过摘眼球法处死小鼠。收集小鼠外周血，常温放置1 h，4 000 r/min 离心10 min 获取血清。开腹后及时、准确地分离并测量小鼠结肠长度并观察其粪便外观、肠道大体形态特征以及有无粘连、狭窄等情况。游离并仔细截取小鼠全侧结肠，在冰生理盐水中沿肠系膜缘处纵行切开肠腔，使肠粘膜得以充分暴露，轻轻刮除肠腔内成型粪便并进行清洗。将剪切成长度1 cm 的多段结肠组织部分于4%多聚甲醛中固定，部分用于刮取以收集肠粘液，部分剥取肠粘膜并置于-80 ℃冻存。

1.5 结肠组织GC-C 表达的检测

采用qRT-PCR 和Western blot 方法检测小鼠肠粘膜组织GC-C 的表达。参照RNA Simple Total RNA kit 试剂盒（天根生物公司）使用说明书的实验步骤，提取组织总RNA。使用Fermentas 逆转录试剂盒合成第一链cDNA 并依照Fermentas SYBR Green 荧光定量检测法试剂盒说明书上的步骤与要求进行荧光相对定量指标的检测，采用2-ΔΔCt方法分析样品GC-C mRNA 的相对表达量。此外，按照试剂盒产品使用技术指导与说明书的要求和方法步骤，快速进行组织总蛋白的提取与纯化并准确的测定蛋白浓度。每孔加入等量蛋白进行电泳分离后均匀转至硝基纤维素膜上，用牛血清白蛋白封闭，与稀释的一抗孵育过夜，次日清晨再与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。最后再以β-actin 为内参计算目的条带与β-actin 灰度比值。

1.6 结肠组织病理学评分

制备石蜡切片，将石蜡切片进行常规脱蜡、水化后，蒸馏水反复洗涤约5 min。经苏木荧光素染色法染色16 min，自来水中反复洗冲以去蜡表面浮色。用1%浓度的稀盐酸酒精水溶液（浓盐酸1 mL 加入99 mL 的75%无水乙醇中配制）反复分化约2 s 后立即以自来水重复洗涤返蓝。室温下伊红染色后沉淀15 s，自来水终止显色并进行梯度酒精脱水各10 min。经对硝基二甲苯乙醇透明溶液沉淀30 min 干燥处理后再用中性树胶封片，在普通的光学显微镜条件下进行观察并记录拍照。请病理科医师使用普通光学显微镜观察结肠组织的炎症损伤情况，并进行组织学炎症评分[8]，见表2。

表2 组织病理学评分标准Tab.2 Histopathological scoring criteria

1.7 外周血清和肠黏液中炎症相关因子的检测

运用ELISA 方法检测外周血清和肠黏液中IL-8 和TNF-a 的水平。根据试剂使用和操作指导说明书上提供的实验操作方法和步骤配制标准液并在标准品孔各加入不同浓度的50 µL 标准液，而各待测样品孔则分别先后添加40 µL 标准样本液和10 µL 的待测样本液。除空白孔外，每孔加100 µL 酶标液后覆板贴置于37 ℃孵育1 h，随即弃去余液并迅速甩干。每孔按照先后顺序依次缓慢均匀滴加显色剂A、B 各50 µL，轻轻震荡混匀后置于37 ℃避光处显色15 min，后每孔再加终止液50 µL 以保证完全终止显色反应。以空白孔调零，在反应过程完全终止后15 min 内用酶标仪在450 nm 波长段依次测量出每个样品的光密度（OD 值）。使用ELISAca1c 软件进行计算和分析即可得到标准品浓度和OD 值之间的标准曲线并计算回归方程，根据所求得的回归方程即可算出待测样本中IL-8 和TNF-α 的含量。

1.8 统计学处理

运用SPSS 17.0 软件进行实验数据的统计与分析。所有实验均平行测定3 份，并至少重复3 次。计量资料以均数±标准差（±s）表示。2 组间均数比较用独立样本t检验，多组间均数比较用单因素方差分析ANOVA 检验，两两比较用q检验。检验水准取值0.05（α=0.05），P＜ 0.05 提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠DAI 评分的比较

实验对照组小鼠活动、反应、觅食及排便正常，体重增加，所有小鼠均存活。结肠炎组的部分小鼠从实验第2 天开始出现腹泻，始见少量黄色稀便，后逐渐加重，甚至可见黏液血便，期间小鼠有四肢懒动，喜扎堆，进食速度减慢、量少，体重下降。实验结束时WT 小鼠结肠炎组死亡1 只，GC-C-/-小鼠结肠炎组死亡2 只。与对照组相比，结肠炎组DAI 评分均明显升高（P＜ 0.05）。其中，GC-C-/-小鼠结肠炎组DAI 评分较WT 小鼠结肠炎组明显升高（P＜ 0.05，图3A）。通过小鼠结肠长度测量结果发现，与对照组相比，结肠炎组小鼠结肠长度明显下降（P＜ 0.05）。GC-C-/-小鼠结肠炎组较WT 小鼠结肠炎组结肠长度亦明显下降（P＜ 0.05，图3B）。

2.2 结肠组织GC-C 的表达

运用实时荧光定量PCR 检测发现，WT 小鼠结肠炎组肠粘膜组织GC-C mRNA 相对表达量WT 小鼠对照组显著降低（P＜ 0.05），而GC-C-/-小鼠对照组和GC-C-/-小鼠结肠炎组肠粘膜组织均无GC-C 表达（图3C）。Western blot 检测结果与qRT-PCR 检测结果一致（图3D）。

图3 各组小鼠DAI 评分、结肠长度和GC-C 表达的比较Fig.3 The comparison of DAI scores，colon length and GC-C expression of mice in each group

2.3 各组小鼠结肠大体形态和长度的比较

肉眼直接观察上述对照组实验小鼠的结肠外观及肠粘膜组织大体结构形态，可见腹腔内组织器官结构的生理解剖位置及形态正常，肠与周围组织脏器之间无黏连，肠粘膜光滑呈淡粉色，无增厚、糜烂、溃疡等。WT 小鼠结肠炎组腹腔内肠与周围组织脏器间轻度黏连，肠壁增厚，肠粘膜表面充血水肿，部分组织表面有浅表性糜烂，未见溃疡。GC-C-/-小鼠结肠炎组较严重，腹腔内肠与周围组织脏器间黏连明显，病变肠段充血增厚，管腔狭小，浆膜面弥漫性充血水肿，肠粘膜表面见大量糜烂，部分肠粘膜可见明显溃疡，见图4。

图4 各组小鼠结肠大体形态的改变Fig.4 The changes of colonic general morphology in each group

2.4 结肠组织病理学评分

通过光学显微镜观察可见，对照组实验小鼠结肠组织中各层结构清晰，上皮细胞层的排列规则且整齐，杯状细胞数量丰富且排列规整，肠腺规则，腺体结构未见异常，固有层可见毛细血管网和少量的散布在周围的淋巴细胞。WT 小鼠结肠炎组肠粘膜层的部分组织结构缺失，杯状细胞数量减少，仅存部分腺体结构，粘膜固有层可见炎症细胞浸润。GC-C-/-小鼠结肠炎组肠粘膜层出现大量组织缺失，杯状细胞明显减少，固有层内见大量的炎症细胞浸润，见图5。通过对各组小鼠结肠组织病理学评分比较发现，GC-C-/-小鼠结肠炎组的组织病理学评分较WT 小鼠结肠炎组显著升高（P＜ 0.05），见图5E。

图5 各组小鼠结肠组织HE 染色图片（X10）和病理学评分的比较Fig.5 The comparison of HE staining picture（X10） and pathological score of colonic tissue in each group

2.5 各组小鼠外周血清和肠黏液中炎症因子水平的比较

运用ELISA 方法检测各组小鼠外周血清和肠黏液中IL-8 和TNF-α 的水平。研究结果显示，与对照组相比，结肠炎组小鼠外周血清IL-8 和血TNF-α 水平均明显增高（P＜ 0.05）。其中，GCC-/-小鼠结肠炎组较WT 小鼠结肠炎组血清IL-8（图6A）和TNF-α（图6B）的表达水平亦明显增高（P＜ 0.05）。各组小鼠肠黏液中IL-8（图6C）和TNF-α（图6D）水平的变化与外周血清一致。

图6 各组小鼠外周血和肠黏液IL-8、TNF-α 水平的比较Fig.6 The comparison of IL-8 and TNF-ɑ in the peripheral blood and intestinal mucus of mice in each group

3 讨论

IBD 由于病程长、复发率高，可引起多种临床表现和并发症，其治疗仍面临着巨大的挑战。常见的IBD 治疗药物包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、抗TNF-α 和抗整合素等生物制剂、抗生素等[9]。但这些药物对部分患者疗效仍欠佳，可能导致患者出现严重的副作用，甚至需要行结肠切除手术，严重影响了患者的生活质量。随着一系列基础研究的开展，出现了许多新的IBD 治疗方法，包括干细胞移植、粪菌移植和某些特殊的饮食治疗等[10-11]。然而，粪菌移植在成人IBD 患者中疗效有限，接受度差，干细胞移植目前也面临很多技术和伦理问题。近年来研究发现，GC-C 信号通路参与保护肠粘膜屏障，具有抗炎、促分化、抑制肠上皮细胞增殖和肿瘤发生、减轻内脏痛觉、维持肠道内稳态等作用[12]。内源性肽Gn/Ugn 通过激活肠上皮细胞顶端表达的GC-C 而发挥作用，Gn/Ugn 与GC-C 结合后可提高细胞内cGMP 水平，然后通过一系列下游的的信号反应使液体分泌至肠腔，GC-C 的内源性配体发挥“流动性感受器”的作用，维持肠道内水电解质平衡及肠黏膜最佳的水合作用[4]。

本研究发现，与野生型（WT）小鼠相比，GCC-/-小鼠在DSS 作用下DAI 评分、结肠组织病理学评分、外周血和肠粘液中炎症因子IL-8 和TNFα 水平均明显升高，表明GC-C-/-小鼠在化学物质诱导下肠道炎症性损伤更严重。结合本课题前期的研究发现，UC 患者肠黏膜组织中GC-C、Gn、Ugn 的表达下调，并与患者的疾病活动度呈负相关[13]。经转染GC-C shRNA 干扰载体的Caco-2细胞在IL-1β 的刺激下，单层细胞的通透性、炎症因子IL-8 和TNF-α 的水平升高，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、肠上皮细胞间紧密连接蛋白claudin-1 和ZO-1 的水平下降更为明显[14]。经注射Gn 过表达慢病毒载体的结肠炎小鼠肠道通透性降低，结肠组织炎症损伤亦明显减轻[7]。以上均提示GC-C 信号通路可能在肠道炎症的发生发展中起保护性作用。与本研究结果一致，Harml-Laws E 等[15]研究发现，与GCC+/+小鼠相比，经腹腔内注射LPS（Lipopolysaccharide，脂多糖）后GC-C-/-小鼠结肠组织的促炎基因表达增加，自发性结肠炎病情加重，提示GC-C 缺乏可能导致严重的肠道炎症反应。然而，关于GC-C 在肠道炎症免疫失调中的作用及机制研究尚存在一定的争议。Fiskerstrand T 等[16]研究报道GC-C 信号的增加可能扰乱了正常的肠粘膜功能，进一步促进肠道炎症的发生。因此，GCC 信号通路可能在肠道炎症的发生过程中发挥不同的作用，只有在生理水平上的配体激活GC-C才能发挥肠粘膜保护作用，GC-C 信号通路的失活和过度激活都会破坏肠粘膜的内稳态，导致一系列肠道疾病如IBD 的易感性[17]。

IBD 的发病与肠粘膜屏障功能受到破坏密切相关，GC-C 信号通路可通过保护肠黏膜屏障而维持肠道内稳态[4]。既往的研究报道，IBD 炎症早期GC-C 信号通路失调可导致肠粘膜屏障功能受损，可能会加速疾病的进展[18]。肠粘膜屏障由肠上皮细胞间的紧密连接蛋白作用于肠上皮形成，调节肠粘膜的通透性并调控粘膜下层及以下的通路。既往研究发现GC-C 可通过调节AKT 依赖的肠上皮屏障完整性而保护肠粘膜，对抗结肠炎和结肠肿瘤的发生[19]。Han X 等[20]研究发现GC-C-/-小鼠和Ugn-/-小鼠的肠道通透性较野生型小鼠高，GC-C-/-小鼠肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达降低，易发生LPS 诱导的肠道炎症损伤，而激活GC-C 后肠上皮通透性降低，紧密连接蛋白的表达上调。此外，Li P 等[21]研究发现GC-C 信号通路失活可引起肠杯状细胞数量减少，导致肠道表面的黏液蛋白和三叶因子分泌减少，而黏液蛋白和三叶因子是肠上皮屏障的重要成分。

综上所述，本研究表明GC-C 基因敲除小鼠在化学物质诱导下肠道炎症性损伤加重，进一步支持GC-C 信号通路在肠道炎症损伤和肠上皮屏障功能中可能发挥保护性作用，GC-C 信号通路可能参与了UC 的发生与发展。然而，GC-C 信号通路的过度激活可导致过多的水分进入肠腔而发生腹泻，未来仍需进一步研究探索GC-C 在IBD等肠道疾病中的作用及机制。