董贺孟，马永杰，赵鹏鹏，沈洁娜，张丹辉，齐 航，靳亚平，雷颖虎*，林鹏飞* (.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌，700;.陕西省秦岭大熊猫研究中心,陕西 楼观台，7040)

秦岭大熊猫是大熊猫的重要亚种种群，具有独特的形态特征和遗传特性，提升秦岭大熊猫种群数量，对于改变秦岭大熊猫种群濒危状况和保护我国大熊猫遗传多样性具有重要的意义[1]。近几年来，人工授精取得成功已成为圈养大熊猫繁育的主要方式[2]。但大熊猫精液资源稀缺珍贵，射精量一般在5 mL以内[2]，如何最大限度地利用其遗传资源，提高人工授精率和繁殖力，一直是人们研究的重点。

精液由精子和精浆组成，精浆中富含蛋白质和各种化学成分，与精液品质密切相关[3]，在雄性生育力判定和不育诊断中有重要的应用价值。目前，针对大熊猫精液特性、精液品质与雄性大熊猫繁育能力关系的研究已有报道[3]，但关于大熊猫精浆成分方面的研究较少。已有研究发现，精浆中果糖的主要作用是为精子活动提供能量来源，是影响雄性繁殖能力的重要指标[4]；精浆中柠檬酸对精子活力和密度有一定的影响[5]；精浆微量元素在精子成熟、运动、激活以及受精过程中发挥着重要作用[6]；精浆中的Zn能维持睾丸内精子生精上皮的功能[7]；精浆中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的浓度会影响精子的活力、质膜完整性和顶体完整性[8]。本试验通过检测4只雄性大熊猫精浆中糖类、微量元素以及ROS等物质含量，比较其对精子活率、质膜完整性和顶体完整性的影响，初步分析精浆指标对秦岭大熊猫精液品质的影响，以期对精液的保存提供一定的理论依据及技术支持。

1 材料与方法

1.1 精液采集在繁殖季节通过电刺激收集陕西野生动物研究中心的性成熟雄性大熊猫的精液。大熊猫在禁食12 h后注射盐酸氯胺酮(8 mg/kg，肌注)和氟烷麻醉，然后对大熊猫进行10～90 mA 电刺激5 s，间隔2 s进行采精。将新鲜精液收集到37℃ 预热无菌杯中，并用稀释剂(Irvine Scientific 90129)按1∶1 稀释。本次大熊猫精液采集工作符合《中华人民共和国野生动物保护法》和《陕西省野生动植物保护条例》的规定。此外，所有操作都经西北农林大学动物护理和实验伦理委员会批准。

1.2 精液的采集与处理在3-4月繁殖季节，通过电刺激收集性成熟雄性大熊猫的精液。采精前大熊猫禁食12 h，注射盐酸氯胺酮(8 mg/kg，IM)和氟烷对大熊猫进行麻醉；使用电射精器给予10～90 mA 电刺激，持续5 s，间歇2 s，进行电刺激采精；将精液直接收集到37℃预热无菌玻璃烧杯中，于1 h内带回实验室进行后续试验。

1.3 精子活率检测使用精子全自动分析仪(Naturegene Sperm Tracker)对上述采集的精液进行活率检测。

1.4 质膜完整性检测采用精子尾部低渗肿胀试验(HOS)分析大熊猫精子质膜完整性。

低渗液配制：称取柠檬酸钠0.735 g，果糖1.35 g溶于100 mL蒸馏水中，用0.22 μm滤器过滤，4℃保存备用(离子浓度0.15 mol/L，渗透压为150 mOsm)。

将低渗液预热至37℃后，用其稀释调整精子密度至1×106～2×106个/mL，然后放入37℃、5% CO2培养箱中孵育30 min，取10 μL滴于血细胞计数板上，400×倒置显微镜下计数400个精子，计算精子尾部出现膨胀的百分率。

质膜完整精子百分率=(尾部膨胀精子数/计数精子总数)×100%

1.5 顶体完整性检测采用异硫氰酸酯荧光素标记的花生凝集素(FITC-PNA，购自VECTOR LABORATORIES)染色法对精子进行顶体完整率检测。在干净载玻片上制备1×105个/mL精子涂片，并使其干燥；甲醇固定10 min后，加入30 μL FITC-PNA染液，置于37℃湿盒，避光孵育30 min；PBS冲洗3次，指甲油封片；置于荧光显微镜下观察，评估400个精子以上。

顶体完整精子百分率=(头部发绿色荧光精子数/计数精子总数)×100%

1.6 精浆指标测定将大熊猫精液于4℃ 1 000 r/min离心10 min，收集上清精浆。柠檬酸(南京建成生物工程研究所)、锌(南京建成生物工程研究所)、果糖(南京建成生物工程研究所)和ROS(江莱生物有限公司)的检测按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计分析使用GraphPad Prism 6.0软件进行数据分析，结果以平均值±标准差表示，采用One-way ANOVA对数据进行统计分析，显著性阈值设置为P<0.05；各参数之间相关性分析采用Pearson检验，其中|r|≤0.500为弱相关，0.500<|r|≤0.800为中等相关，|r|>0.800为强相关。

2 结果

2.1 秦岭大熊猫精液品质的检测如表1所示，采集的4只秦岭雄性大熊猫年龄为12～17岁，体质量为113～125 kg，采精量为2.6～7.5 mL。4只雄性大熊猫的平均精子活率为(82.75±5.74)%、质膜完整性为(81.04±4.35)%，顶体完整性为(47.10±8.11)%，其中Panda B和Panda C的精子活率、质膜完整性和顶体完整性显著高于Panda A和Panda D(表2，P<0.05)。

表1 雄性大熊猫基本信息

表2 精子活率以及质膜和顶体完整性检测 %

2.2 秦岭大熊猫精浆指标检测对上述4只雄性大熊猫的主要精浆指标检测结果如图1所示，Panda D中ROS含量显著高于其他3只大熊猫(P<0.01)，其他3只大熊猫ROS含量无差异，平均值为(17.63±1.03) U/L；Panda B和Panda C的柠檬酸以及Zn含量无差异，但均显著高于Panda A和Panda D(P<0.01)；4只大熊猫间果糖含量无差异，平均值为(4.41±0.26) g/L。

图1 雄性大熊猫精浆指标检测结果

2.3 秦岭大熊猫精浆指标与精液品质相关性分析表3中Pearson相关性分析结果所示，精浆中ROS含量与精子活率、质膜完整性和顶体完整性呈显著负相关性，柠檬酸和Zn含量与精子活率、质膜完整性与顶体完整性呈显著正相关性，而果糖含量与精子活率、质膜完整性和顶体完整性无相关性。

表3 精浆指标与精液品质相关性分析

3 讨论

人工授精过程中，精液质量尤为重要，直接影响受精的成败。精液由精子细胞和基质精浆共同组成。精浆中富含精子活动需求的蛋白质、酶和各种营养物质(果糖、柠檬酸和锌等)，具有保护精子活力、质膜和顶体完整性的作用。有研究表明，大熊猫精浆中谷草转氨酶活性与精子活力呈极显著负相关[9]；大熊猫精浆中乙酰水解酶水平与精子活力等质量指标呈显著负相关[10]。以上研究证明精浆中的成分直接影响精子的质量，因此探究大熊猫精浆成分含量具有重要意义。

果糖是精液中精子的唯一能量来源，被分解后形成ATP，直接为精子的运动提供动力支持，果糖含量较低时，精子存活率也会较低[6]。有研究表明，在人医上正常果糖浓度患者精子浓度明显低于异常果糖浓度患者，精子浓度同精浆果糖浓度之间有着密切关系[11]，但是本试验研究显示，精浆中果糖浓度对秦岭大熊猫的精子活率、顶体和质膜完整性无显著相关性。综合来看，这4只大熊猫的精子活率整体处于较高水平，为(82.75±5.74)%，因此(4.41±0.26) g/L 果糖对精液品质无显著影响，这可能和种属差异有关。Zn是精浆中重要的微量元素之一，具有维持睾丸内精子生精上皮的功能，可促进雄性动物生殖器官发育，影响垂体分泌促性腺激素，同时参与精子内糖的酵解和氧化过程，保护细胞膜结构和功能的完整性[12]。研究证明，给予严重少精症患者适当补充 Zn 可能会有效改善精液质量[13]；精液黏稠度增高组精浆Zn含量亦明显下降[14]。大熊猫精浆中Zn含量与精子活率、顶体和质膜完整性呈极显著正相关，进一步证实了Zn对大熊猫精液品质发挥重要的调节作用。柠檬酸是由前列腺细胞分泌，主要生理功能是维持精液的渗透压及酸碱度平衡，同时提高精子的活力。本试验中柠檬酸与精子活率、顶体和质膜完整性呈正相关，证实了柠檬酸的含量会影响大熊猫精液品质。雄性动物生殖器官在生精过程中会产生大量的ROS，ROS会对精子的质膜、顶体等结构完整性造成损害，从而对精子的受精能力造成不可逆转的破坏[15]。Panda D中ROS含量显著高于其他3只大熊猫，同时Panda D的精子活率、顶体和质膜完整性是最低的，可能表明Panda D精浆中高浓度的ROS对精液品质产生了显著影响。目前已有研究表明在大熊猫精液稀释液中加入白藜芦醇等具有抗氧化作用的添加物，可保护大熊猫精子免受氧化应激[16]。本试验中所得的结果可为后续开展大熊猫精液保存技术提供一定的理论支持，根据已有研究，或可通过对大熊猫精液保护液中添加相关物质来延长大熊猫精液保存期，提升大熊猫精液保存质量。

综上所述，果糖浓度对秦岭大熊猫的精子活率、顶体和质膜完整性无显著相关性；Zn含量与精子活率、顶体和质膜完整性呈极显著正相关；柠檬酸含量与精子活率、顶体和质膜完整性呈正相关；ROS含量与精液品质呈显著负相关。因此，在精液保存中，可通过在大熊猫精液保护液中添加相关物质来调整精浆中Zn、柠檬酸及ROS含量进而提升精液保存质量。