何纪元，李心慰，王 哲，刘国文，宋玉祥 (吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

奶牛亚临床酮病(subclinical ketosis，SCK)是围产期高发的代谢性疾病，其病理学基础为围产期奶牛采食量降低而泌乳需求增加导致的能量负平衡，发病率高达40%[1]。SCK奶牛为了缓解能量短缺而过量动员体脂，导致非酯化脂肪酸产生过多，超过肝脏代谢能力而被不完全氧化成β-羟基丁酸(β-hydroxybutyric acid，BHBA)，造成血液高浓度的BHBA。另外，SCK奶牛还存在系统性炎性反应，表现为血液急性期反应蛋白和促炎细胞因子水平升高[2]。系统性炎性反应不仅直接损害奶牛的生产性能和繁殖能力，缩短了奶牛的寿命，还会增加奶牛感染性疾病的发病率，导致乳品业受到巨大损失[3]。BHBA可以作为能量底物缓解奶牛能量负平衡，然而过量蓄积则会引起细胞损伤和免疫系统紊乱，是系统性炎性反应的潜在诱因。

中性粒细胞(polymorphonuclear granulocyte，PMN)在炎性反应放大中起着重要作用，其过度募集可导致组织损伤和慢性炎症[4]。PMN以可逆的方式黏附在内皮或细胞外基质上，启动趋化过程[5]。整合素与配体之间的相互作用介导其与血管内皮细胞的牢固黏附，进而招募到炎症部位[6]。PMN上表达最高、研究最广泛的整合素为淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function association antigen-1，LFA-1)和巨噬细胞相关抗原-1(macrophage-1，Mac-1)，其分别是由β2整合素的α-亚单位(CD11a和CD11b)和β-亚单位(CD18)组成的异二聚体。小鼠巨噬细胞的LFA-1或Mac-1缺失或被阻断可降低其黏附和运动能力[7]，而其过表达与则增强巨噬细胞和内皮细胞之间的黏附，导致系统性炎性反应[8]。在人和大鼠研究中，BHBA可增加单核细胞和巨噬细胞黏附相关分子的表达，并对组织和器官造成损害[9]。而BHBA对奶牛PMN黏附的影响及其机制尚不清楚。

本研究旨在明确SCK奶牛的系统性炎性反应状态，明确BHBA对奶牛PMN黏附功能的影响并探索其调控机制，为进一步了解SCK奶牛系统性炎性反应的发生机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂D-37520低温高速离心机购自德国Thermo Fisher公司；CO2细胞培养恒温箱购自日本三洋公司；通用型电泳仪购自美国Bio-Red公司；CD11a抗体购自北京博奥森公司；β-actin抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；TNF-α、IL-6、IL-1β、内毒素结合蛋白(LBP)、触珠蛋白(Hp)和血清淀粉样蛋白(SAA)的ELISA检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；BHBA粉末购自天津灏洋生物公司；鼠尾Ⅰ型胶原蛋白购自北京索莱宝公司。

1.2 实验动物所有实验动物均来自长春某万头奶牛场。健康奶牛的选择标准为：血清BHBA<0.6 mmol/L、GLU>3.0 mmol/L；SCK奶牛的选择标准为：血清1.2 mmol/L

1.3 血清指标检测使用相应试剂盒检测血清指标。将已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的辣根过氧化物酶(HRP)。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B和酶结合物同时作用。于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的D值，以吸光度D值为纵坐标(Y)，相应的待测物质标准品浓度为横坐标(X)，做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其D值由标准曲线换算出相应的浓度。

1.4 PMN分离与培养使用PMN提取试剂盒提取外周血PMN。将A液和C液按照体积比为2∶1的比例加入离心管中，形成梯度界面。将等体积含有抗凝剂的血液样本缓慢加入分离液面上，室温条件下800×g离心30 min。离心后收集PMN层，加入洗涤液，混匀后再次离心。弃上清，加入2～3倍体积的红细胞裂解液，吹打混匀，5～10 min后1 000×g离心5 min，得到PMN，用RPMI-1640培养基将细胞重悬，并将细胞密度调整为2×106个/mL，进行后续黏附或蛋白免疫印迹试验。

1.5 黏附试验通过计算PMN黏附于包被了Ⅰ型胶原蛋白的96孔板的数量来评估PMN的黏附能力。将Ⅰ型胶原蛋白按照说明书稀释为0.012 g/L。将96孔板每孔加入50 μL稀释后的Ⅰ型胶原蛋白溶液后于超净工作台过夜晾干。将PMN加入孔内，放入细胞培养箱培养2 h，而后使用冷的PBS冲洗，将未黏附的PMN洗掉。使用相差显微镜(×40)观察，随机选取不同区域计算平均黏附细胞数。

1.6 蛋白免疫印迹收集细胞后，加入适量含有PMSF的裂解液，冰上裂解25 min，12 000 ×g离心10 min上清即为该组细胞总蛋白。使用BCA法测定蛋白质量浓度，按照体积比4∶1加入5×蛋白上样缓冲液。95℃金属浴5 min使蛋白变性。按照电泳、转膜、封闭、一抗4℃过夜孵育、TBST洗膜(6 min，3次)、二抗室温孵育45 min和TBST洗膜(6 min，3次)的试验步骤进行试验。最后将PVDF膜放在数字成像仪，滴入适量显影液进行曝光。

1.7 PMN RNA的提取及PCR扩增用1.5 mL无RNase的离心管收集PMN，每管加入1 mL的RNAiso Plus，室温裂解5～10 min后，加入200 μL氯仿充分混匀后冰上静置5 min。4℃ 12 000×g离心15 min，吸取上层无色液体，加入等体积异丙醇混匀，冰上静置10 min。于4℃ 12 000×g离心15 min得到白色沉淀。用DEPC水配置的75%乙醇洗涤RNA后再次离心。用适量DEPC水将得到的RNA溶解，使用分光光度计检测RNA的质量浓度。使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。用实时荧光定量PCR法检测TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平，所用引物相关信息见表1。

2 结果

2.1 健康奶牛与SCK奶牛的血液生化标检测通过检测和分析健康与SCK奶牛血液生化指标发现：相较于健康奶牛，SCK奶牛干物质采食量明显下降；血清BHBA浓度明显升高；血糖浓度明显下降；血清急性期反应蛋白SAA和HP水平均明显增加；血清炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平均明显升高(表2)。结果表明，SCK奶牛存在能量负平衡和系统性炎性反应。

表2 健康和SCK奶牛相关血液指标检测

2.2 BHBA增强奶牛PMN黏附能力使用1.6 mmol/L的BHBA处理PMN 0，1，2，4，6 h后进行黏附试验，发现BHBA处理2 h后PMN的黏附数量明显增多(P<0.01)(图1)。

A.1.6 mmol/L BHBA处理0 h后中性粒细胞黏附图像；B.1.6 mmol/L BHBA处理1 h后中性粒细胞黏附图像；C.1.6 mmol/L BHBA处理2 h后中性粒细胞黏附图像；D.1.6 mmol/L BHBA处理4 h后中性粒细胞黏附图像；E.1.6 mmol/L BHBA处理6 h后中性粒细胞黏附图像；F.A中PMN黏附细胞的定量分析；Scale Bar=200 μm。每个样品至少随机拍摄10个不同部位的图片。**示P<0.01，具有极显著性差异。下同图1 BHBA对PMN黏附功能的影响

2.3 BHBA增加奶牛PMN主要黏附蛋白的表达通过蛋白免疫印迹试验检测了BHBA(1.6 mmol/L)处理后PMN相关蛋白的表达情况，结果表明相较于对照组，BHBA处理2 h后，CD11a、CD11b和CD18的蛋白水平均显著增加(P<0.01)(图2)。

A.BHBA处理0，1，2，4，6 h后PMN主要黏附分子CD11a、CD11b和CD18的蛋白丰度；B.A中CD11a的相对表达水平定量分析；C.A中CD11b的相对表达水平定量分析；D.A中CD18的相对表达水平定量分析图2 BHBA对PMN黏附相关主要蛋白表达的影响

2.4 BHBA提高PMN促炎细胞因子mRNA水平使用1.6 mmol/L BHBA刺激2 h后，奶牛PMN中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平均显著升高(P<0.01)，说明PMN炎性因子转录水平升高(图3)。

1.6 mmol/L的BHBA刺激PMN 2 h后TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平的定量分析图3 BHBA对PMN炎性因子表达的影响

3 讨论

围产期SCK奶牛处于NEB和系统性炎性反应状态。血液病理学表现为代谢产物BHBA和非酯化脂肪酸、促炎细胞因子和急性期反应蛋白水平升高[10]。系统性炎性反应不仅可以使代谢性疾病的发病风险增加了7 倍，还会抑制雌激素分泌，进而抑制卵母细胞的发育，导致奶牛繁殖性能降低[11]。另外，由于系统性炎性反应的存在，酮病奶牛更容易继发炎症性疾病，例如乳腺炎、子宫内膜炎和蹄叶炎等，这将进一步加剧其对经济效益的危害[12]。本研究确证了SCK奶牛血液BHBA、促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和急性期反应蛋白(HP和SAA)的含量均显著升高，说明SCK奶牛存在高BHBA血症及系统性炎性反应。

炎症反应是一把双刃剑，既可以保护机体免受病原或其他异体物质的侵害，又在反应过度时导致组织损伤，从而产生各种副作用，如生产性能下降、器官功能损伤、甚至死亡。活化的PMN不仅释放趋化因子和促炎细胞因子，还可以通过脱颗粒和细胞外诱捕网作用以及释放活性氧、蛋白水解酶和抗菌蛋白等促炎介质，扩大炎症级联反应。与此同时，发生炎症反应的组织或器官的实质细胞也会分泌各种炎症因子，协同吸引血液中的PMN附着并迁移进入局部炎症部位，建立正反馈循环，从而诱发更加复杂的炎症反应。因此PMN的过度募集将导致持续的炎症反应和局部组织损伤[13]。有研究指出，BHBA可以通过增加CD11b和细胞间黏附分子-1的表达量增强人单核细胞与内皮细胞之间的黏附[14]。整合素的表达增加促进单细胞黏附到内皮细胞，进而激活NADPH氧化酶和氧化应激诱发机体炎性反应[15]。BHBA还可以通过NF-κB信号通路诱导牛肝细胞炎性因子表达量升高[16]。本研究发现体外BHBA刺激能够使PMN整合素表达量增加，黏附功能增强，同时炎性因子表达量增加，提示血液高浓度的BHBA可能是SCK奶牛系统性炎症发生的原因。

细胞外基质与整合素相互作用引发的信号需要通过整合素相关蛋白的激活被转导到细胞中[17]。越来越多的证据表明，整合素聚集可以通过激活焦点黏附激酶(focal adhesion kinase,FAK)启动细胞内信号介导促炎细胞因子的产生。FAK通过与丝氨酸蛋白激酶和TNF-α受体相关因子相作用，对调节下游TNF-α信号至关重要[18-19]；与蛋白酪氨酸磷酸酶形成复合体，激活MAPK并增强基质金属蛋白酶-9表达，从而有助于IL-1β信号通路传导[20-21]；FAK磷酸化抑制剂可以降低p-38、ERK和JNK的磷酸化介导的促炎因子的表达[22]。因此，BHBA引起的奶牛PMN黏附增强可能通过激活FAK进一步调控其促炎能力，但该假设仍需要进一步验证。

总之，本研究确证了SCK奶牛存在系统性炎性反应和血液高浓度BHBA水平，并通过体外试验证实病理浓度BHBA可以增强PMN的黏附、增加主要黏附分子和促炎细胞因子的表达，为进一步了解SCK奶牛系统性炎性反应的发生机制提供了一定的理论基础。