罗连响 陈心铭 郑羽诗 罗 辉 （广东医科大学海洋医药研究院，湛江 524023）

铁死亡（ferroptosis）是一种区别于细胞凋亡、细 胞坏死、细胞自噬和细胞焦亡的新型细胞程序性死亡方式，由脂质过氧化和致命活性氧积累导致，与肿瘤病理生理过程密切相关［1-3］。铁死亡可能在癌症治疗中，尤其是在根除对传统治疗有抵抗力的恶性肿瘤时引发，癌细胞比正常细胞对铁的需求量大，这种铁依赖性可使癌细胞更易受铁死亡影响。全新的铁死亡诱导剂有望成为治疗耐药性癌症的新方法［4-5］。

胃癌（gastric carcinoma，GC）是全球第五大常见癌症和第三大癌症死亡原因，是一种分子和表型高度异质性的消化道疾病，世界范围内存活率仅为30%，由于人口老龄化，每年新发病例仍在增加［6-8］。胃癌发生与幽门螺杆菌感染和年龄等因素相关［9-10］。随着放疗和化疗技术进步，早期GC 的五年生存率可达到95%，但多数患者诊断时已经是晚期，晚期GC 预后较差，主要治疗方法为分子靶向治疗、免疫治疗及新辅助化疗［11-12］。

GC中一些基因在调节铁死亡中起重要作用，如GPX4 和SLC7A11 表达可增加ROS 积累从而促进GC 细胞铁死亡，SCD1、EIF4A1 和perilipin2 表达可抑制GC 细胞铁死亡［13-16］。此外，TIMP1 与铁死亡存在联系，在GC中过度表达［17］；TIMP1可能是GC预后的生物标志物［18］；CDO1 对胃癌细胞中Erastin 诱导的铁死亡具有调控作用［19］。但铁死亡相关基因（fer⁃roptosis-related gene，FRG）是否与GC 患者预后相关仍有待研究。

因此，本研究基于TCGA 患者mRNA 表达谱和临床数据构建了一个与铁死亡相关的预后模型，在GEO 队列中进行了验证，并对其功能富集和免疫打分相关性进行分析，旨在开发一种预测GC 患者总生存率（overall survival，OS）的FRG签名和列线图模型，探讨其可能作用机制，为GC 患者个性化治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 表达数据和临床数据收集 研究流程图如图1所示。通过TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库获取胃癌（Stomach adenocarcinoma，STAD）样本基因表达及相关临床信息，共得到403例STAD样本用于训练组研究。通过美国国立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GEO（Gene Expression Omnibus）数据库获取数据集GSE84426的基因表达数据和临床信息，共得到76例GC 样本被纳入验证组研究。两组临床特征如表1所示。胃腺癌代表了多数胃恶性肿瘤［20］，占胃恶性肿瘤的95%，因此来自TCGA-STAD 和GSE84426 的样本可代表胃腺癌样本。

图1 FRG预后模型构建Fig.1 Construction of prognosis model of FRG

表1 纳入本研究的GC患者临床特征［例（%）］Tab.1 Clinical characteristics of GC patients included in this study［n（%）］

1.2 筛选预后相关的差异基因 从FerrDb（http：//www.zhounan.org/ferrdb/）收集了290个FRG。采用R软件limma 包对数据进行整理，提取出245FRG，筛选出115 个差异表达基因（differential expression genes，DEG,fdr<0.05，|logFC|>0.5）。采用R 软件survival 包、单因素Cox 分析得到28个预后相关基因（P<0.05），比较后得到的10个差异表达的FRG具有预后价值用于构建预后模型。

1.3 预后模型的构建和验证 基于上述10 个基因，采用R 软件glmnet包进行LASSO-Cox回归分析，构建预后模型。患者风险评分=∑（每个基因表达水平×相应系数）。根据风险评分的中位数将患者分为高风险组和低风险组。受试者操作特征（ROC）分析检验独立风险因素预测生存率的敏感性和特异性，评估模型预测准确性。t-SNE 和PCA 分析探讨高风险组和低风险组分布。

1.4 功能富集分析 采用R 软件clusterProfiler 包进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析，探讨不同分子机制及高、低风险患者差异。GO 分析包括生物学过程、细胞成分和分子功能。

1.5 免疫细胞和免疫相关通路评分的相关性分析 采用R 软件GSVA 包中的单样本基因集富集分析（ssGSEA）进一步量化16 个免疫细胞的浸润水平和13个免疫相关通路活性。

1.6 统计学分析t检验用于确定肿瘤组织和正常组织中差异表达的FRG。采用卡方检验比较各组比例构成差异。Mann-Whitney 检验评估风险组间免疫细胞或途径ssGSEA 得分差异，并采用BH 方法调整P值。采用Kaplan-Meier分析和对数秩检验（Logrank test）比较各组OS。单因素和多因素Cox 回归分析确定OS 的独立预后因素。所有统计分析均采用R 软件（4.0.3）完成。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA-STAD队列中预后相关DEG筛选 TCGASTAD 队列中筛选出115 个铁死亡相关DEG，其中14 个与OS有关（图2A）。14 个铁死亡相关DEG 中，8个基因在肿瘤组织中上调，6个基因在肿瘤组织中下调（图2B）。单因素Cox 分析显示，14 个基因均与GC患者OS显著相关，其中9个为危险基因（HR>1），5 个为保护基因（HR<1）（图2C）。相关性网络显示14 个有预后价值的铁死亡相关DEG 相关（图2D）。STRING 数据库下载的PPI 网络表明基因间相互作用（图2E）。14 个基因中ATG16L1、CAV1、CDO1、DUSP1、GABARAPL1、HIF1A、LONP1、MYB、NFE2L2、NOX4、SLC1A5和TGFBR1在肿瘤组织和正常组织中表达差异有统计学意义（P<0.05，图2F），其中ATG16L1、HIF1A、LONP1、MYB、NOX4、SLC1A5 和TGFBR1 在肿瘤组织表达上调，为致癌基因；CAV1、CDO1、DUSP1、GABARAPL1 和NFE2L2 在肿瘤组织表达下调，为抑癌基因（图2F）。

图2 TCGA-STAD队列中有预后价值的DEG筛选Fig.2 Screening of DEG with prognostic value in TCGASTAD cohort

2.2 10 基因预后模型构建 LASSO-Cox 回归分析得到10 个有预后价值的DEG（表2，基因全称来自https：//www. 360zhyx. com/），构建预后模型（图3）。以风险评分中位数为临界值，将TCGA-STAD 队列患者分为高风险组（n=159）和低风险组（n=158）。Kaplan-Meier曲线显示高风险组生存时间缩短（图4A，P<0.01）。ROC 曲线评价模型预测性能，曲线下面积（AUC）在3 年时达到0.693，4 年时达到0.695，5 年时达到0.700（图4B）。图4C 显示患者被分为高、低风险两组。高风险组患者生存时间较低风险患者生存时间缩短（图4D）。PCA 和t-SNE 分析显示，不同风险组患者分为两个方向（图4E、F）。

表2 预后签名中的基因Tab.2 Genes in prognostic gene signatures

图3 TCGA-STAD队列10基因预后模型构建Fig.3 Construction of 10 gene prognosis model in TCGASTAD cohort

图4 TCGA-STAD队列基于10基因预后模型的生存分析Fig.4 Survival analysis in TCGA-STAD cohort based on 10 gene prognostic model

2.3 10 基因预后模型的验证 将GSE84426 队列患者分为高风险组（n=38）和低风险组（n=38）。GSE84426队列生存分析结果与TCGA-STAD队列生存分析结果相近（图5，P<0.05，AUC 在3 年时达到0.678，4年时达到0.686，5年时达到0.691）。

图5 预后模型验证Fig.5 Validation of prognostic model

2.4 独立预后分析 单因素Cox 回归分析中，分期较高是TCGA-STAD 队列和GSE84426 队列患者OS的不利因素（TCGA-STAD：HR=1.833，95%CI=1.256～2.674，P=0.002；GSE84426：HR=2.690，95%CI=1.042～6.943，P=0.041，图6A、C）。多因素Cox回归分析中，年龄较大在TCGA-STAD 队列中显示出更差的OS（HR=2.038，95%CI=1.395～2.976，P<0.001，图6B）。此外，高风险是两组患者OS 的不利因素（TCGA-BRCA：HR=4.238，95%CI=2.507～7.613，P<0.001；GSE84426：HR=2.137，95%CI=1.057～4.319，P=0.034，图6B、D）。因此，风险评分是OS 的独立预后因素。图6E显示了TCGA-STAD 队列构建的列线图，采用4个预后因素（年龄、性别、分级和分期），可根据影响生存的预后因素的比例对患者进行打分。

图6 独立预后分析Fig.6 Independent prognostic analysis

2.5 功能富集分析 GO 分析显示，来自TCGA 队列风险组间的DEG 主要富集于细胞外基质组织和细胞外结构组织。细胞成分方面，DEG 主要富集于含胶原细胞外基质（图7A）。KEGG 途径分析显示，黏着斑和PI3K-Akt信号通路显著富集（图7B）。

图7 GO和KEGG功能富集分析Fig.7 Enrichment analysis of GO and KEGG functions

2.6 免疫细胞和免疫相关途径 TCGA 队列高风险组中，B 细胞、CD8+T 细胞、树突状细胞、未成熟树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞、辅助性T 细胞、滤泡辅助性T 细胞、TIL细胞和调节性T细胞的免疫细胞亚群显著上调（所有调整后的P<0.05，图8A）。至于免疫相关通路，APC 共刺激、CCR、检查点、副炎症、T 细胞共刺激和Ⅱ型IFN 反应显著上调（均经校正P<0.05，图8B）。通过GSE84426 队列的高风险组验证，B 细胞、滤泡辅助性T 细胞、TIL 细胞、T 细胞共刺激和Ⅱ型IFN反应均被证实（均经调整P<0.05，图8C、D）。

图8 TCGA-STAD 队列和GSE84426 队列高风险组和低风险组ssGSEA得分Fig.8 ssGSEA scores of high-risk group and low-risk group in TCGA-STAD cohort and GSE84426 cohort

3 讨论

GC患者晚期预后较差，五年生存率较低使开发稳定的预后指标变得非常重要。本研究基于TCGA数据建立了一个包含10 个基因签名的铁死亡相关模型预测GC 预后，并在GSE84426 队列中验证其预测准确性。上述两个队列中，高风险组GC 患者生存期均短于低风险组。此外，风险评分是GC 患者独立的预测因子，与临床特征和免疫功能密切相关。

本研究通过对10 个铁死亡相关基因的功能分析，确 定MYB、SLC1A5、NFE2L2、ATG16L1 和LONP1 为 保 护 基 因，TGFBR1、ZFP36、DUSP1、HIF1A和NOX4为危险基因。根据FerrDb，TGFBR1、HIF1A、MYB、SLC1A5、DUSP1 和NOX4 是促进铁死亡的驱动因素，而NFE2L2 和ZFP36 是预防铁死亡的抑制剂（http：//www. zhounan. org/ferrdb/）。对于TGFBR1，Linc00462过表达提高TGFBR1和TGFBR2表达，从而促进胰腺癌侵入性［21-22］。此外，TGFBR1表达可促进GC 发展［23］。MYB 在多种白血病和癌症中过度表达，与ROS 递质改变有关［24］。SLC1A5 表达的蛋白是一种细胞表面转运蛋白，转运中性氨基酸［25］。miR-137 通过直接靶向谷氨酰胺转运体SLC1A5 负性调节黑色素瘤细胞铁死亡［26］；SLC1A5表达可抑制GC 细胞增殖［27］。NFE2L2（NRF2）可促进癌细胞增殖，其表达可能增强GC 细胞对治疗的抵抗力［28-29］。另外，NFE2L2 过表达促进了对铁死亡的抵抗。ARF 介导的铁死亡在很大程度上被NFE2L2 共表达所消除。NFE2L2 基因抑制增强了铁死亡易感性（http：//www.zhounan.org/ferrdb/）。研究发现ZFP36在肝星状细胞铁死亡调控中起关键作用，可抑制铁死亡，并确定ZFP36自噬依赖性铁死亡是治疗肝纤维化的一个潜在靶点，ZFP36 质粒通过破坏ATG16L1 mRNA 稳定性抑制自噬激活，ATG16L1 质粒可消除ZFP36 质粒对铁死亡的抑制作用，与GC 易感性相关［30-31］。ATG16L1是自噬相关的基因［32］，本研究发现ATG16L1 与铁死亡有关，其在GC 组织中表达上调，且与正常组织表达差异显著。有研究阐明了LONP1 与铁死亡的关系，LONP1抑制其对胰腺导管腺癌PANC1 细胞铁死亡的保护作用［33］。DUSP1 在erastin 或RSL3 诱导的铁死亡过程中表达上调（http：//www.zhounan.org/ferrdb/）不稳定的HIF1A 促进肿瘤细胞铁死亡［34］。土荆皮乙酸通过激活NOX4 和抑制xCT 可引起胶质瘤细胞铁死亡［35］。

单因素Cox 回归分析中，分期和风险评分与OS显著相关。多因素Cox 回归分析显示，风险评分是一个独立的预后因素。为更好地预测GC 患者的OS，本研究将风险评分与临床特征相结合，建立了GC患者列线图。

功能富集分析表明，风险评分改变主要与细胞外基质组织、细胞外结构组织和PI3K-Akt 信号通路有关。PI3K-Akt 信号通路参与细胞周期进展、凋亡和肿瘤转化，是肿瘤治疗靶点，与较差预后有关。作为正常细胞过程中最重要的信号通路之一，PI3K-Akt 信号通路可作为治疗GC 和胰腺癌的潜在治疗策略［36-37］。另外，PI3K 的活动也与其他肿瘤相关，包括肺癌、黑色素瘤和白血病［38］。

免疫评分和免疫评分相关性分析表明，高风险组中，B 细胞、CD8+T 细胞、树突状细胞、未成熟树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞、辅助性T 细胞、滤泡辅助性T 细胞、TIL细胞和调节性T细胞的免疫细胞亚群显著上调，B 细胞、滤泡辅助性T 细胞、TIL 细胞在GSE84426 队列中得到了验证。已知B 细胞、T 细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、TIL 细胞和调节性T 细胞的增加预示GC 患者不良预后，因此高风险组预后较低风险组预后差［39-44］。在免疫相关途径方面，APC共刺激、CCR、检查点、副炎症、T 细胞共刺激和Ⅱ型IFN 反应显著上调，T 细胞共刺激和Ⅱ型IFN 反应被验证组证实，均为上调。程序性死亡-1-导向（PD-1-导向）免疫检查点阻断法可将持久的抗肿瘤活性赋予多种晚期恶性肿瘤。Ⅱ型IFN 反应是癌细胞和宿主细胞中PD-L1表达的关键驱动因素［45］。高风险组Ⅱ型IFN 反应在这两个队列中上调，而Ⅱ型IFN 反应有利于抗肿瘤活性增强，因此高风险组预后较差的原因可能是T 细胞共刺激的作用大于Ⅱ型IFN 反应的作用。本研究也有局限性，如仅采用公共数据库，需要更多临床验证。

总之，本研究应用TCGA 和GEO 数据集构建并验证了铁死亡相关基因的预后模型，该模型是与OS相关的独立因素。此外，本研究还开发了一个列线图，医师可应用列线图提高高风险GC 患者识别的准确性，实现精准治疗。