刘啸宇，后梦情，程安琪，胡传俊，姚 坤，吴 萧

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州 234200）

农杆菌介导法是目前转化双子叶植物最为广泛使用的方法之一，该方法简单，转化机制明确、周期短，同时因转入基因的拷贝数少，因此大大地降低了因同源抑制而产生基因沉默的可能性[1]。同时，该技术具有转育周期较短、遗传性状较为稳定、变异幅度较小、对农艺和经济性状干扰较少等特点，已成为我国农作物进行外源基因导入时最常用的技术手段[2-3]。但同时也面临一些重要的技术问题，如转化效率低和转化结果的未知性和不可控性等。为了进一步了解根癌农杆菌T-DNA 转运的分子机制，探讨是否可以通过提高T- 复合物招募蛋白VBP 在农杆菌细胞内的表达量来提高T-DNA 的转化效率，这在植物转基因方面的应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 所用菌株

Agrobacterium tumefaciensC58，E.coliDH5α，实验室保存，菌液与70%的甘油等体积保存在冻存管中，冻存于-75 ℃冰箱中。

1.1.2 所用质粒

Prset-a，具有T7 启动子，实验室保存；pegfp-n1，含有egfp基因的质粒，实验室保存；prset-agfp1，Atu4856 基因上游495 bp 序列，带上标记基因gfp，插入启动子已除去的prset-a 质粒，构建。

1.1.3 所用引物

所使用的引物信息（划线部分为酶切位点） 见表1。

表1 所使用的引物信息（划线部分为酶切位点）

1.2 试验方法

1.2.1 用聚合酶链式反应扩增带有标记基因的Atu4856启动子序列

（1） 扩增495 bp 的启动子序列。以Pv1、Pv2 为引物，BamHⅠ酶切位点在引物Pv1 上，配制反应体系进行PCR 反应，结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，并回收产物[4-5]。

（2） 聚合酶链式反应扩增标记基因——gfp。……