李海普，袁娜迪，李 跃

(中南大学a.化学化工学院;b.环境与水资源研究中心，湖南 长沙 410083)

对羟基苯甲酸酯(paraben)是一类广泛用于个人护理品、食品和药物中的防腐剂[1-2].它在世界各地的自然地表水中被广泛检测到[3].Paraben对自然水体中的生物具有一定的毒性[4].同时paraben容易通过生态循环被人体吸收从而对人类健康产生危害[5-7].目前发现paraben对人体的内分泌系统和生殖系统具有较大危害，可能会导致人体患上癌症[8-9].因此生态系统中paraben类污染物的去除显得十分重要.

目前paraben类物质的去除主要发生在污水处理厂中.污水处理技术主要分为物理法[10]、化学法[11]、生物法[12].其中物理法存在设备成本和能耗高，化学法存在催化剂成本高和工艺复杂的不足之处.随着生物法的发展，微生物降解技术因为其独特的优势而被应用于paraben的降解[13].例如，Valkova等[14]从一种商业膳食矿物质补充剂中分离出的阴沟肠杆菌菌株能够在15 min内完全降解6.6 mmol/L的对羟基苯甲酸甲酯.

本研究选取paraben中常见的3种物质(对羟基苯甲酸乙酯(EtP)、对羟基苯甲酸丙酯(PrP)和对羟基苯甲酸丁酯(BuP))作为目标污染物，用实验室从活性污泥中分离出的细菌1a51对其进行降解，研究了工艺条件对细菌1a51降解目标污染物的影响，并考察了该降解在不同水体中的应用情况.研究结果将为微生物法降解环境中的paraben提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 实验设备

SHA-CA型水浴恒温振荡器(常州普天仪器制造有限公司)，Waters-2998型高效液相色谱(美国沃特世有限公司)，AR224CN型精密电子天平(奥豪斯仪器有限公司)，UPT-Ⅱ-10T型超纯水机(四川优普设备仪器有限公司)，HCB-1300V型超净工作(青岛海尔生物医疗股份有限公司)，PHS-25型pH计(雷磁电科学仪器有限公司)，SPX-150B-Z型生化培养箱(上海博讯实验有限公司医疗设备厂)，YXQ-100G型立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实验有限公司医疗设备厂).

1.2 实验试剂

Mn(NO3)2、Zn(NO3)2·6H2O、Cu(NO3)2、Ni(NO3)2、Co(NO3)2·6H2O和Cd(NO3)2·4H2O购自国药集团化学试剂有限公司，NaOH和HCl购自西陇化工股份有限公司.EtP、PrP和BuP购自上海麦克林试剂公司，实验中使用的超纯水(UP水)用超纯水机现制现用.实验培养细菌的培养基信息见表1.

表1 实验所用的培养基

1.3 实验及仪器分析方法

1.3.1 降解实验方法

实验室采用平板划线法，经过四代的分离和纯化，最终从活性污泥中提取到一株对paraben具有降解特性的实验细菌.根据培养过程中从每代编号的培养基中逐一提纯的顺序，将该菌株命名为1a51[15-16].对该菌株进行16SrDNA分子学鉴定，在NCBI(national center of biotechnology information)网站上进行同源基因序列比对(Blast)和分析发现，该菌株属于表皮葡萄球菌属(Staphylococcus epidermidis)[17].细菌1a51降解EtP、PrP和BuP的实验采用控制变量法，在细菌生长48 h后加入3种目标污染物，保持培养基条件不变，每间隔1 h从培养基中取1 mL溶液，然后通过高效液相色谱采用外标法来测定溶液中目标污染物的浓度.所有工作在超净工作台里完成,实验中设置3个平行对照组.

1.3.2 仪器分析方法

采集的溶液样品需要经过离心机离心，取其上清液经过0.22 μm针式过滤器过滤后装入液相色谱进样瓶中，采用高效液相色谱检测3种parabens的浓度.仪器及色谱条件如下：色谱柱型号为ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，保护柱型号为EC-C18(4.6 mm×15.5 mm，2.7 μm)，进样体积为25 μL，色谱柱温度设为25 ℃，流动相为甲醇和超纯水，流速为1 mL/min，流动相配比见表2，紫外检测波长为254 nm.

表2 梯度洗脱条件

2 结果和分析

2.1 目标物初始质量浓度对降解的影响

在温度为35 ℃、R2A液体培养基初始pH为7、降解时间为12 h条件下，考察了菌株1a51对各初始质量浓度分别为2、4、6、8和10 mg/L的3种共存目标物的降解情况.3种物质的浓度变化如图1所示.由图1可以看出，在考察时间内，3种目标物的质量浓度均随着时间推移而降低.在12 h内，3种物质基本都能完全被降解，其中BuP降解得最快，在4 h时基本完全被降解；其次是PrP，在6 h时质量浓度降到0 mg/L；EtP降解得最慢，需要12 h才能全部消除.由物质的质量浓度变化趋势可以看出，在前6 h内，EtP降解较慢，而在这期间，PrP和BuP很快被降解完全；在后6 h内，体系中没有PrP和BuP的存在，EtP被细菌快速降解，3种物质在一定时间内的降解趋势是BuP>PrP>EtP.可以明显看出3种物质降解速度的差异与物质的结构有关，即paraben的酯基部分碳链越长，其被降解的速率越快.这与文献[18]报道的污泥体系对PrP的降解规律一致.可能是酯基部分碳链越长，越容易被细菌吸附在表面，从而优先被菌株1a51降解.

图1 目标物初始质量浓度对细菌1a51降解的影响

细菌表面一般会有孔隙存在，使得其具有一定的疏水性，从而影响细菌在其他生物和非生物上的粘附能力以及其摄取有机物的能力[19].为了明确菌株表面吸附目标有机物在paraben去除中的作用，实验将3种目标物加入生长期被灭活的细菌1a51培养体系中，每间隔2 h检测培养基里3种目标物的质量浓度，定量测定细菌1a51表面对目标物的吸附能力.从图2可以看出，灭活后的细菌1a51对3种parabens有微弱的吸附能力，其中对BuP的吸附稍强.细菌对3种目标物的吸附能力大小为BuP>PrP>EtP，这应该是随着碳链的增加，paraben疏水性增强，正辛醇/水分配系数增大，更有利于被细菌表面所吸附[20].这个规律与细菌降解3种parabens的速率一致.同时发现，由细菌表面吸附而带来的paraben质量浓度降低非常有限，说明体系中paraben的消失主要来自细菌的降解作用.

图2 细菌1a51对3种parabens的吸附作用

在3种目标物的初始质量浓度各为10 mg/L、降解时间为12 h时对其降解动力学进行考察发现，PrP和BuP能够较好地符合一级动力学模型，相关系数R2分别为0.954和0.985，反应速率常数分别为0.410 h-1和1.061 h-1(见图3(a))，而EtP的降解不符合一级动力学模型.分析原因,可能是由于本体系是一个三物质共存体系，物质间存在竞争关系[21].如图3(b)所示，在前6 h内主要是PrP和BuP被降解，而在后6 h内EtP被快速降解.对EtP降解过程的后6 h部分进行一级动力学拟合得到，相关系数R2为0.996，反应速率常数为0.486 h-1(见图3(c))，符合一级动力学函数[22].

图3 细菌1a51对3种parabens的降解动力学

2.2 pH对降解的影响

pH会影响到细菌表面所带的电荷，影响表面孔隙的通透性，从而影响细菌对营养物质的摄取吸收，对它的生长产生影响[23].实验在温度为35 ℃、各目标物初始质量浓度均为10 mg/L、降解时间为12 h条件下，研究了细菌1a51在不同pH(5、6、7、8、9)培养基里对目标物的降解情况.如图4所示，随着pH从5升高到9，体系最终剩余的目标污染物的质量浓度先降低后增加.在pH=7时细菌对3种物质的降解效果最好，物质的平均去除率达到98%，因此可以看出该细菌适宜的降解环境应为中性.

图4 pH对细菌1a51降解的影响

2.3 温度对降解的影响

已有研究表明，温度是影响细菌能否高效降解氯嘧磺隆的主要因素[24]，这是因为温度过高或过低均可明显抑制细菌的活性[25].因此实验需要考察温度对细菌1a51降解能力的影响.在R2A液体培养基初始pH=7、各目标物初始质量浓度为10 mg/L、降解时间为12 h条件下，细菌1a51在不同温度(15、25、35、45 ℃)下对目标污染物的降解情况如图5所示.

图5 温度对细菌1a51降解的影响

在15 ℃和45 ℃时，细菌对3种目标物的降解效果均较差，15 ℃时3种目标污染物的平均降解率为45%，45 ℃时仅有BuP的降解率达到80%以上，其它2种物质的降解率均低于45%.这可能是由于过热使酶失去活性，从而使菌体衰老提前，导致菌种数量减少[26]；而低温会使细菌代谢变缓，有机物质的分解受到抑制[27].在35 ℃的环境下，3种目标物都能被较快降解，10 h即可被完全降解.

2.4 金属离子对降解的影响

考虑到自然环境的水体中不仅含有丰富的有机物，也存在着大量的金属离子，实验考察了6种金属离子(Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Cd2+，Ni2+)存在的情况下细菌1a51对3种目标污染物降解情况.在温度为35 ℃、R2A液体培养基初始pH=7、各目标物初始质量浓度为10 mg/L条件下，向体系中分别加入不同质量浓度(0.1或1 mmol/L)的各金属离子，考察一定时间内(EtP降解10 h，PrP和BuP降解6 h)各目标物的降解率，结果如图6所示.可以看出不同的金属离子对降解的影响存在差异.当离子质量浓度为0.1 mmol/L时，各金属离子对细菌1a51降解3种防腐剂有微弱的抑制作用(与空白组(BK)相比)；浓度升高，抑制作用有些许增强.其中抑制作用最强的是Cd2+.有报道显示，Cd2+具有较强的生物毒性，它会损伤菌株细胞，使其结构发生变化[28].3种parabens中BuP的降解几乎不受低浓度金属阳离子的影响，而EtP和PrP受一定程度的抑制.

图6 金属离子对细菌1a51降解的影响

2.5 不同水体中的降解

为考察细菌1a51在实际水体中对目标物的降解情况，实验采集了5种水样(湘江水，河水，湿地水，自来水和UP水)，过滤处理后用其制得不同水体基质的培养基，在温度为35 ℃、初始pH=7、各目标物初始质量浓度为10 mg/L的条件下，考察了一定时间内(EtP降解10 h，PrP和BuP降解6 h)目标物的降解率，结果如图7所示.可以看出同一物质在不同基质中的降解顺序为UP水>自来水>湿地水>河水>湘江水.这可能与环境水体中有机物、金属离子种类及含量差异等因素有关，但整体上，细菌1a51在各水体中仍然具有较好的降解能力.不能忽略的一个问题是，实际水体中存在大量的土著微生物，细菌1a51在其中能否适应、繁殖并发挥其降解能力，需要进一步深入研究.

图7 水体基质对细菌1a51降解的影响

3 结论

研究了细菌1a51对3种parabens防腐剂在不同温度、pH值及不同目标物初始质量浓度下的降解规律，结果表明：细菌1a51在35 ℃下的中性培养基中，能够将初始质量浓度为2～10 mg/L的各防腐剂完全降解；在parabens共存体系中，3种物质的降解存在竞争关系，细菌1a51优先降解酯基中碳链较长的目标物，3种物质完全降解所用时长顺序为BuP