嵌合型受体（CAR）-T细胞疗法的出现为复发或难治性血液瘤患者提供了新的治疗选择，然而仍存在着疗效不佳、在实体瘤中存活时间短、迁移到肿瘤部位的细胞数量有限以及受实体瘤免疫微环境抑制等诸多问题。利用核医学报告基因分子成像技术实现CAR-T细胞体内示踪，有助于明确回输后CAR-T细胞在体内的迁移、定位、浸润和扩增的动态过程，预测可能出现的细胞因子释放综合征（CRS）的严重程度,帮助优化治疗方案并避免潜在风险。目前用于核医学成像的报告基因主要有4类，分别为酶报告基因、钠碘转运体报告基因（NIS）、受体报告基因和抗体报告基因。其中NIS属于钠-葡萄糖共转运体膜蛋白家族成员，在甲状腺滤泡基底膜上内源性表达，因具有特异性摄取碘同位素及碘类似物的特性，应用于PET/SPECT显像可高灵敏、高特异性示踪体内细胞获得高信噪比图像，从而在肿瘤细胞，干细胞示踪中得到广泛应用。

农机深松整地技术推广是农业生产过程中的重要任务，为了促进农机推广工作顺利推进，必须要对推广管理体制进行完善。由于在传统的农机推广过程中对农机深松整地技术的推广工作不够重视，导致一部分推广人员有所懈怠。对此，相关部门必须要明确农机深松整地技术的重要性，加强对农机深松整地技术推广工作的安排，需要在原有的工作制度基础上进一步完善。例如要加强对农机深松整地技术人员的考核，将人员的考核与推广工作结合起来，完成推广任务的人员可以获得相应的奖励，没有完成任务的人员将会受到一定惩罚，以奖罚分明的措施带动技术人员的积极性，使其加深对农机推广工作的认识，深入到基层，对群众开展教育和引导。

运用NIS报告基因示踪CD19 CAR-T细胞有望为解决目前CAR-T药物临床治疗存在的问题提供新的思路，然而报告基因的插入与表达可能会导致靶细胞存在诱变风险因此NIS在CD19 CAR-T细胞上共表达对CD19 CAR-T细胞原本活化增殖能力及杀伤活性可能造成的影响仍有待进一步确认。目前关于NIS示踪CAR-T细胞的研究较少，2018年Emami-Shahri等将NIS报告基因共表达于靶向前列腺特异膜抗原（PSMA）的CAR-T 细胞，用TcO作为示踪剂评估了PAMA CAR-T细胞的体内分布，2020年Volpe等首次报告了利用NIS报告基因在乳腺癌模型中对ErbB CAR-T细胞的PET成像。既往研究均缺乏NIS报告基因共表达影响CAR-T细胞体外增殖的探讨，对NIS-PAMA CAR-T细胞和NIS-ErbB CAR-T细胞杀伤活性可能存在的变化的研究内容不足，缺少对不同效靶比的设置及较长时间点的观测。因此，本研究制备靶向CD19的NIS-CAR-T细胞，系统性探究NIS共表达对于CD19 CAR-T细胞活化增殖和杀伤活性的影响，旨在为实现核医学技术监测血液瘤患者体内CD19 CAR-T细胞生存-工作状态奠定基础。

⑧柳永《卜算子》(江枫渐老)：双调89字，上阕8句45字4仄韵，下阕8句44字5仄韵。句式：4464635346。5544635345。

1 材料和方法

1.1 材料

细胞株：Nalm6细胞购于浙江美森细胞科技有限公司，293T细胞由重庆医科大学放射医学与肿瘤学实验室提供；T细胞由已签署知情同意书的健康成人志愿者提供。慢病毒：CD19 CAR慢病毒质粒（爱康得生物科技苏州有限公司）、NIS 慢病毒质粒（汉恒生物技术上海有限公司）。试剂：RPMI 1640培养液、胎牛血清（FBS）（GIBCO）、T细胞扩增培养基、白介素-2（IL-2）、淋巴细胞密度梯度分离液、人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂、人T细胞分离试剂盒（STEMCELL公司；磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）（上海碧云天生物技术有限公司）、APC抗人EGFR抗体（Biolegend）、台盼蓝染液（上海经科化学科技有限公司）、CCK8试剂盒（日本同仁化学研究所）、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒（LDH Cytotoxicity Assay Kit）（上海碧云天生物技术有限公司）、ELISA试剂盒（R&D）、I（重庆原子高科医药有限公司）。

1.2 方法

上述方式再次铺板后每孔细胞分别加入0.05、0.1、0.2、0.4µCiI，检测细胞碘摄取量随I浓度及孵育时间的变化。每个浓度3孔，分别孵育0.5、1、2、3和6 h后测量细胞的放射性计数，操作同前。为了后续进行外排实验,将本次测量时间点记为0。测量后将细胞重悬于PBS 缓冲液中,室温下培养15、30、60、120 min 后用冷PBS缓冲液洗涤3 次，γ计数器测量细胞相应时间点放射性计数。重复上述实验3 次。

1.2.2 CAR-T细胞、NIS-T细胞及NIS-CAR-T细胞的制备 采健康成人志愿者外周血，密度梯度离心法获得外周血单个核细胞（PBMC），免疫磁珠富集法获得CD3T细胞群。1×10CD3T细胞加入1 mL T细胞扩增培养基（含人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂25µL、IL-2 500 IU）激活扩增。活化后的CD3T 细胞CAR 慢病毒MOI=7.5、NIS 慢病毒MOI=50感染48 h 分别获得CAR-T细胞、NIS-T细胞及NIS-CAR-T细胞，细胞密度维持在1×10/mL 37 ℃、5%CO继续培养。

在出租车上，思雨还想再同田诗研究一下回家之后的一些细节问题。可田诗根本就没给他机会。田诗就发生在姐夫身上的长发丝事件，结合当前的现实社会和成功男人等社会问题，展开了深入细致的剖析。实际上也是变相地给思雨敲敲警钟上上课。虽然大家目前还没有发现杜思雨有什么问题，但田诗想的是应该让姐夫思雨的坏思想萌芽胎死腹中，对他要警钟长鸣。

1.2.4 细胞体外增殖能力检测 T细胞、CAR-T细胞及NIS-CAR-T细胞96孔板3000/孔分别铺板。每孔加入100µL T细胞扩增培养基（含IL-2 50 U），37 ℃、5%CO分别培养24、48、72 h。CCK-8 细胞增殖毒性检测试剂盒进行增殖能力检测，酶标仪测定，计算各孔增殖率，增殖率（%）=（-）÷（-）×100%。每组设3 个复孔，实验重复3 次。

1.2.5 体外杀伤活性检测 CD19表达阳性的急性B淋巴细胞白血病Nalm6细胞株RPMI 1640（1%青霉素/链霉素10%胎牛血清）37 ℃5%CO培养，定期进行支原体污染检测。

径流量数据具有非线性和不确定性等特征，并且与时间相关，因此，对径流量的预测也可以看作是时间序列的预测问题。求和自回归移动平均(ARIMA)模型是一种基于时间序列的预测模型，适用于对时间序列的短期和超短期预测，

ELISA试剂盒检测4∶1效靶比72 h共培养上清中IFN-γ、TNF-β浓度。每组设3个复孔，实验重复3次。

T细胞培养24、48、72 h增殖率（%）分别为111.82±11.72、150.46±6.20、313.20±6.39；CAR-T细胞培养24、48、72 h 增殖率（%）分别为112.37±8.6、152.09±13.6、323.52±16.92；NIS-CAR-T细胞培养24、48、72 h增殖率（%）分别为97.35±8.12、149.61±17.75、312.49±12.10。3组细胞都具有良好的体外增殖性，增殖率差异无统计学意义（＞0.05，图3）。

1.2.1 CAR慢病毒、NIS慢病毒制备 CD19 CAR慢病毒由爱康得生物科技苏州有限公司合成，NIS慢病毒由汉恒生物技术上海有限公司合成并经DNA测序验证。慢病毒分装保存于-80 ℃。

仿真采用文献[21-24]中的方法，建立DELTA机器人的雅可比矩阵，以及运动学、动力学模型，然后求出轨迹的坐标、速度、加速度以及力矩的值，仿真中DELTA机器人平台的参数如表1所示。

1.3 统计学分析

每个客户、每个区域都不一样。比如，在吉林三岔河库、蔡家库，农民更需要农资和农机服务；在辽宁，农民对贷款的需求呼声更高；在内蒙古，订单农业连片种植业务开展更快。根据不同地理环境、农民实际需求和市场趋势，“粮圈儿”可以把服务做到每户农民家里，不再“大水漫灌”。

2 结果

2.1 慢病毒载体构建

CD19 CAR慢病毒质粒采用的是第3代CAR，胞外CD19 scFV 连接胞内2个共刺激分子CD8 与4-1BB，再与CD3ζ 串联，末端自我剪切肽2A连接一个EGFR标签，用于检测CD19-CAR的转染效率。NIS慢病毒质粒中包括目的基因NIS和绿色荧光蛋白（GFP），末端2A连接一个嘌呤霉素（Puromycin）抗性基因（图1A）。GFP用于检测NIS的转染效率，经测序与预期相符。带有GFP的NIS慢病毒感染293T包装细胞后荧光显微镜下可见NIS-293T细胞表达绿色荧光（图1B）。

流式细胞术数据采用FlowJo软件进行分析，其余实验数据用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，样本两两比较使用LSD-检验，多组总体差异比较采用单因素方差分析。＜0.05表示差异具有统计学意义。

1.2.3 慢病毒转染率检测 CAR-T细胞、NIS-T细胞及NIS-CAR-T细胞培养3 d，流式细胞仪（BD Biosciences）检测转染效率，FlowJo软件分析数据。

2.2 CAR-T细胞、NIS-T细胞及NIS-CAR-T细胞转染效率检测

CD19 CAR慢病毒携带EFGR标签，NIS慢病毒携带GFP。APC-抗人EGFR抗体对感染后T细胞染色后，检测APC 通道荧光和GFP 荧光占比即可得到CAR、NIS感染率。CAR-T细胞、NIS-CAR-T细胞的CAR转染率和NIS-T细胞、NIS-CAR-T细胞的NIS转染率（%）分别为91.91、99.41、47.83、50.24（图2A～C）。

我国的改革开放和市场经济发展历程，实际上也是我国政府职能逐步转换的过程。2018年3月修订了新的政府综合财务报告编制指南，这一制度的提出有利于不断改进政府会计的制度管理，推进政府会计改革，更加科学地反映政府整体运行成本状况和运营绩效水平，从而建立健全政府会计标准体系。目前已有20多个省、自治区、直辖市、计划单列市以及20个中央部门成为我国权责发生制政府综合财务报告改革的试点区域。本文以浙江省温州市为案例进行分析，通过分析近年来温州市在编制政府综合财务报告过程中出现的难点和问题，提出合理的建议和解决措施。

2.3 CAR-T细胞与NIS-CAR-T细胞的体外增殖

1.2.6 体外摄碘能力检测 T 细胞、NIS-T 细胞、NISCAR-T细胞12孔板2×10/孔分别铺板。每孔分别用PBS缓冲液洗涤3次，其中6孔加入新鲜培养基（100 μL/孔），剩余6孔加入KI（10 mmol/L）100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，每孔加入100 μL 含有I（0.2µCi）的新鲜培养基孵育30 min。冷PBS缓冲液洗涤细胞3次，γ测量仪（PerkinElmer，WIZARD2）测量每孔细胞的放射性计数。重复上述实验3次。

2.4 CAR-T细胞与NIS-CAR-T细胞对Nalm6细胞的体外杀伤活性

各组杀伤活性随共培养时长及效靶比的增加而升高（图4A～D），CAR-T、NIS-CAR-T细胞组杀伤活性明显强于对照组，差异均具有统计学意义（＜0.05，表1）。比较CAR-T与NIS-CAR-T细胞对Nalm6细胞杀伤率发现，不同效靶比（0.5∶1、1∶1、2∶1 和4∶1）作用24 h 时，CAR-T细胞组杀伤率高于NIS-CAR-T细胞组，差异具有统计学意义（＜0.05）；作用48、72 h两组细胞杀伤率差异无统计学意义（＞0.05）。

5×10靶细胞（Nalm6细胞）中按照效靶比为0.5∶1、1∶1、2∶1和4∶1分别加入效应细胞（T细胞、CAR-T细胞和NIS-CAR-T细胞），分别培养24、48、72 h。LDH法酶标仪测定值检测杀伤活性，计算各孔杀伤率。杀伤率（%）=（--）÷（-）×100%。

CAR-T、NIS-CAR-T两组IFN-γ、TNF-β释放水平（pg/mL）均高于T细胞组（1495.77±1.1，1366.76±69.2587.14±0.85；675.43±2.93，601.30±11.3365.10±8.85，＜0.05，图4E），差异具有统计学意义。

2.5 NIS-T细胞与NIS-CAR-T细胞的摄碘能力

体外摄碘实验结果显示，无竞争性抑制剂KI存在的情况下，0.2µCiI孵育30 min后，NIS-T细胞与NISCAR-T细胞每分钟放射性计数（cpm）明显高于对照组T细胞，差异具有统计学意义（7851±837，7231±481721±29，＜0.05，图5A）；KI存在时NIS-T细胞与NISCAR-T 细胞I 摄取（cpm）被明显抑制，与对照组相比无明显变化，差异不具有统计学意义（986±65，972±66938±50，＞0.05，图5A）。其中NIS-T细胞、NIACAR-T细胞摄碘水平呈浓度依赖性增高（图5B），摄碘3 h 达到峰值（图5C），去除I 后细胞内I 快速流出并在30 min后cpm值趋于稳定。NIS-CAR-T细胞摄碘水平与NIS-T细胞相比差异不具有统计学意义（＞0.05，图5D）。

3 讨论

CAR-T疗法的出现改变了血液性肿瘤治疗的格局，但目前依然存在着细胞因子风暴（CRS）和免疫效应细胞神经毒性综合征（ICANS）等并发症问题。利用NIS报告基因成像策略提高对CAR-T细胞体内行为的认识与了解有助于推动解决目前CAR-T细胞治疗所存在的一系列问题。然而NIS作为报告基因，其插入与表达是否存在导致靶细胞诱变、原本功能受抑制等风险是一个十分值得关注的问题。目前有研究将NIS用于示踪CAR-T 细胞在前列腺肿瘤和乳腺癌肿瘤模型中的分布，但均未对NIS报告基因共表达是否影响CAR-T细胞体外增殖和杀伤活性进行系统探讨。因此区别于前两项报道，本研究选择CD19 CAR-T细胞作为示踪对象，通过慢病毒感染法制备CAR-T细胞与NISCAR-T细胞，探究NIS是否适用于示踪CD19 CAR-T在血液性肿瘤中的“工作-生存”状态。流式细胞术结果显示CD19 CAR与NIS表达阳性证明制备成功，并且两组细胞CAR转染率相近，表明NIS共表达对CAR的表达无抑制现象。

制备出的CAR-T细胞、NIS-CAR-T细胞参照T细胞培养法进行体外培养，通过对比共表达NIS与CD19 CAR蛋白的T细胞与只表达CD19 CAR蛋白的T细胞体外24、48、72 h的细胞增殖率差异，以研究NIS基因的插入与表达对CD19 CAR-T细胞的增殖活性是否存在影响。CCK8结果显示二者体外增殖率无差异，均具有良好增殖能力。随后本研究将CAR-T细胞、NIS-CART细胞作为效应细胞与Nalm6肿瘤细胞按不同效靶比共培养，对表达不同蛋白的T细胞的肿瘤杀伤率进行对比。LDH结果显示各组杀伤活性随共培养时长及效靶比的增加而升高，CAR-T、NIS-CAR-T细胞组杀伤活性明显强于对照组。不同效靶比作用24 h时，CAR-T细胞组杀伤率高于NIS-CAR-T细胞组，48、72 h两组细胞杀伤率无差异。提示随着共培养时间的延长，两者对肿瘤细胞杀伤作用差异也趋近于无，NIS-CAR-T细胞与CAR-T细胞一样具有良好的杀瘤活性。说明NIS共表达不影响CAR-T细胞体外增殖活性和对肿瘤细胞识别与杀伤功能。ELISA法检测效靶比4∶1作用72 h CART、NIS-CAR-T 两组共培养上清均存在明显IFN-γ、TNF-β释放再次表明NIS-CAR-T细胞与CAR-T细胞均能够特异性识别CD19抗原分泌细胞因子并发挥杀伤作用。这与评价共表达其他报告基因（如HSV1-tk、eDHFR、SSTR2受体以及PSMA等）CAR-T细胞肿瘤杀伤活性的研究结果一致。

报告基因在靶细胞中转录、翻译、表达的成功是其在成像过程中发挥功能的基础，因此为了进一步探究NIS与CAR共表达时CAR蛋白是否影响NIS的表达与功能,确保NIS能实现细胞体内示踪作用，我们对比了NIS-CAR-T与NIS-T两组细胞NIS转染率与摄碘能力，流式细胞术结果表明NIS-CAR-T与NIS-T两组细胞NIS转染率相似提示NIS转染率不受影响，碘摄取实验结果表明共表达NIS蛋白具有特异性摄碘功能。这与Emami-Shahri等以TcO作为示踪剂得到的NISPSMA CAR-T细胞SPET/CT成像结果和Volpe等报告的乳腺癌模型中NIS-ErbB CAR-T细胞的PET成像结果相符。

综上所述，本研究通过实验发现NIS 共表达对CD19 CAR-T细胞增殖、杀伤活性无明显抑制作用，其本身表达与摄碘能力均未受影响，证明NIS有作为理想的报告基因用于CD19 CAR-T细胞体内示踪的潜质，为后续利用NIS 介导放射性核素在血液癌模型中实现CAR-T细胞可视化研究奠定了基础。