冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，其发病率及病死率逐年升高，严重威胁人类健康；其最常见的形式是心肌梗死（MI）。CHD最有效的治疗措施是尽早尽快恢复缺血区域血流，减少急性心肌缺血性损伤和梗死范围。但缺血一段时间后的血流恢复会导致继发的心肌缺血再灌注损伤，许多复杂的过程参与缺血再灌注损伤，包括离子积累、线粒体膜电位破坏、活性氧（ROS）的形成、一氧化氮代谢失调、血小板聚集、免疫激活、凋亡和自噬。

自噬在缺血再灌注损伤中被显著激活，同时也是心肌缺血再灌注损伤的主要调节过程。有研究发现，mTOR是自噬的重要调控分子，在不同条件下可以通过PI3K/AKT/mTOR、AMPK/mTOR/ULK1信号通路调控自噬。研究报道自噬过程对心脏发育，结构和功能的基本形成具有重要意义，广泛参与多种心血管疾病的发生发展，如心力衰竭、心肌病、缺血性心脏病和缺血再灌注损伤等。研究表明，多种药物均可通过mTOR调控心肌细胞自噬水平，从而改善心肌I/R损伤，但具体作用机制尚不明确。

由悬挂系统与下层桥架的装配关系(见图4),为使桥架移动时因轨道不平导致耳板销轴与轴壳孔不同心度较大时仍能正常工作,耳板通过关节轴承与销轴连接,因轴承主要承受径向载荷,故选用向心关节轴承.

6)第一次空中三角测量预测了导入的控制点在影像上的大概位置，由此减轻了人工寻找控制点点位的负担。这种方法还可以用来发现和排查野外像控点错误。

盐诱导激酶2（SIK2）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶属于AMPK家族成员，本课题组已有关于SIK2在脑缺血再灌注过程中对大鼠能量代谢的影响研究。有研究表明，SIK2在细胞自噬体成熟和自噬过程中发挥重要作用，但是SIK2是否通过自噬影响心肌缺血再灌注以及作用机制目前尚未明确。本研究旨在探究SIK2通过mTOR/ULK1信号通路调控细胞自噬对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响,从而为临床心肌缺血再灌注损伤的治疗提供一个新的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

4～6周龄的SD雄性大鼠（体质量200～220 g），由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2019-0014。本研究所有动物均经皖南医学院动物保护与伦理委员会批准（LLSC-2022-005）。大鼠随机分为3组（5只/组），假手术对照组：只用丝线穿过左冠脉不结扎；缺血再灌注组：缺血30 min，灌注2 h；SIK2抑制组：术前24 h，使用博舒替尼对大鼠进行左股静脉给药，给药剂量为10 mg/kg；24 h 后进行缺血30 min，再灌注2 h。

将大鼠心脏组织在4%多聚甲醛中浸泡24 h后进行脱水、包埋、切片和染色。取完整心脏组织从心尖部开始分割成3等份，保证每片心脏组织的厚度为2～3 mm（均为横断面），放入全自动脱水机；利用梯度乙醇和HE染液分别将心肌细胞的细胞质和细胞核染成红色和蓝色，中性树胶封片后，光学显微镜下观察细胞结构及形态的改变。

1.2 主要材料

SIK2抑制剂博舒替尼（Bosutinib）为碧云天公司产品；兔多克隆抗体抗SIK2和兔多克隆抗体GAPDH（货号bs-6930R、bs-0755R，北京博奥森技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（货号A0208，碧云天生物技术有限公司）；兔多克隆抗体LC3B（货号A7198，ABclonal）；兔多克隆抗体Beclin 1、p-ULK1（Ser757）、ULK1、mTOR、p-mTOR（货号3495、14202、8054、2983、5536，CST）；兔多克隆抗 体p62（货 号AF5384，affinity）。小动物呼吸机（HX-101E）、小动物心电图机（BL-420S）（成都泰盟软件有限公司）；超声仪器（EPIQ7C，探头L12-，飞利浦）。

本发明公开了一种利用钼尾矿代替黏土制备普通硅酸盐水泥熟料的方法，它涉及建筑材料制备技术领域。将原料石灰石、钼尾矿和调整剂以质量百分比分别为70%～85%、5%～20%、0%～10%进行混合,待搅拌均匀后，将混合料进行粉磨制成生料,将生料输送至干法回转窑系统中煅烧，煅烧结束后冷却后形成普通硅酸盐水泥熟料。利用钼尾矿工业固体废弃物生产普通硅酸盐水泥熟料，其不仅可以代替黏土，保护耕地，消耗了对社会环境有害的工业废弃物，为工业废料的绿色处理提供了一种途径。钼尾矿是选钼、选铁后剩下的固体物理，选钼选铁过程中已经进行磨矿，因此磨粉成本有所降低。

1.3 建立心肌缺血再灌大鼠模型

采用SPSS 21.0软件进行数据分析。正态分布的计量数据以均数±标准差表示，两组之间比较采用独立样本检验，多组间比较采用单因素方差分析，＜0.05为差异有统计学意义。

1.4 构建SIK2减少组心肌缺血再灌注模型

造模前24 h，经腹腔麻醉后将大鼠固定在鼠板上。左侧股静脉处剪开，分离出左股静脉，随后注射器缓慢注射博舒替尼10 mg/kg（2～3 min），注射完毕后按压5 min，缝合，消毒绷带包扎，24 h后开始建立心肌缺血再灌注模型。

1.5 超声检测心功能

取之前存于-80 ℃冰箱的心肌组织，切取左心室组织，剪碎，加入裂解液，研磨后冰上静置30 min，离心后取上清液即为总蛋白含量，进行分装。分装后的样本与5×上样缓冲液混匀后95 ℃变性7～10 min，进行上样、凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加一抗（SIK2、LC3B、Beclin 1、p62、p-ULK1（Ser757）、ULK1、mTOR、p-mTOR，稀释比例均为1∶1000），4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，10 min/次，加入二抗，稀释倍数为1∶10 000，孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL化学发光底物，化学发光检测仪检测蛋白表达。以GAPDH为内参，采用Image J软件对图像中条带的灰度值进行相对定量分析。

1.6 HE染色观察心脏病理学改变

相对凝血功能障碍和严重酸中毒，体温的尽早恢复显得更为重要。因为正常的体温是维持有效的凝血及代谢酶联反应的关键，只有中心体温超过35 ℃才可能出现正常的凝血功能[10]。研究表明，中度低体温(32～34 ℃)每减少1 ℃能够直接影响血小板凝血功能及减少10%凝血因子活性[16-17]。本研究结果显示，研究组患者的术后体温恢复时间、休克纠正时间、乳酸清除时间、PT恢复时间和住院时间均少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。提示，术前ISS相近的严重腹部创伤患者接受DCS手术有利于术后患者病情恢复，DCS理念对高原严重腹部创伤的救治具有重要意义[11]。

1.7 蛋白质印迹检测

将大鼠麻醉，使用超声多普勒血流仪检测左心室功能，至少检测3个连续、完整的心动周期，指标为大鼠左心射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（FS）、舒张末期室间隔厚度（IVSDd）、舒张末期左室后壁厚度（LVPWDd）。

1.8 统计学方法

大鼠禁食10 h后，腹腔注射25%乌拉坦（4～5 mL/kg）麻醉，待大鼠完全麻醉后将大鼠固定于恒温鼠板上，记录正常心电图，消毒并备皮，剪开颈部正中皮肤，暴露颈部气管，进行气管插管，连接小型动物呼吸机进行机械通气。自左侧3～4肋间开胸，轻压右侧胸廓暴露心脏，迅速穿线结扎冠状动脉左前降支(假手术组大鼠只穿线不结扎)，将心脏送回胸腔内，快速挤出胸腔内空气随后立即关闭胸腔。观察心电图变化，以ST段抬高或下降0.2 mV为造模成功标志，缺血30 min后开胸，松解结扎线使血流再灌，缝合胸部皮肤，再灌注2 h 后取心脏，-80 ℃冻存或4%多聚甲醛浸泡。

2 结果

2.1 模型的构建及评价

缺血再灌注组与正常组大鼠相比，大鼠心电图ST段显著抬高，T波与QRS波逐渐融合，表示心梗模型成功（图1）。

近年来，各医学院校相继开展机能实验学整合。机能实验学课程的开展，是医学院校实验教学改革的必然要求。该课程除了教师和学生两大主体的参与，也离不开实验技术人员。随着学科建设不断深入，机能实验课程内容变得更加充实和复杂，对参与者提出了更高要求。实验技术人员的工作水平从一定程度上反映了机能实验中心的教学水平、科研水平和管理水平。但是，目前实验技术人员的工作素养与实际工作缺乏有机结合，工作现状亟待改善。

2.2 SIK2与大鼠心肌缺血再灌注的相关性

如今已是西藏大学理学院教授、钟扬的学生拉琼发现，病后稍有恢复的钟老师开始变本加厉地工作，一天排满了各种事。他的衣袋里总是装着很多小纸片，上面密密麻麻写满各种待办事项，每做完一项就用笔划掉。

与假手术组比较，缺血再灌注组SIK2蛋白表达增多（＜0.01，图2A）。可以确定心脏组织缺血再灌注后SIK2表达增多。

对正常大鼠博舒替尼左股静脉注射，剂量分别为5 mg/kg、10 mg/kg，24 h后直接取其心脏，结果发现10 mg/kg剂量时大鼠心脏组织SIK含量被明显抑制（＜0.01，图2B）。根据结果决定使用10 mg/kg的剂量来作为实验剂量。

2.3 各组大鼠心脏组织病理学改变

与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠LVEF、FS值显著降低（＜0.001），与缺血再灌注组相比，SIK2抑制剂组大鼠LVEF、FS升高（＜0.01），LVPWDd、IVSDd值3组无明显差别（＞0.05，表1、图4）。

2.4 超声观察各组大鼠心功能的改变

假手术组心肌纤维成分无肿胀紊乱，心肌间质无炎症细胞浸润。缺血再灌注组，心肌细胞水肿，部分心肌细胞出现核溶解、核碎裂，心肌纤维中间出现空洞，坏死心肌细胞周围可见大量急性炎症细胞浸润。SIK2抑制剂组显示心肌组织细胞病理变化减轻（图3）。

2.5 各组大鼠中自噬蛋白的表达情况

与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表达增多（＜0.01），p62 蛋白表达降低（＜0.001）；与缺血在再灌注组相比，SIK2抑制剂组大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表达降低（＜0.05），p62蛋白表达增高（＜0.01，图5）。

2.6 SIK2通过mTOR/ULK1信号通路调控自噬

与假手术组相比，缺血再灌组大鼠p-mTOR蛋白表达显著降低（＜0.0001），p-ULK1（Ser757）蛋白表达增高（＜0.01）；与缺血再灌注组相比，SIK2抑制剂组大鼠p-mTOR蛋白表达增高（＜0.01），p-ULK1（Ser757）蛋白表达降低（＜0.05）；3组mTOR、ULK1蛋白表达无明显差别（＞0.05，图6）。

2.7 TEM观察各组大鼠心肌细胞自噬情况

假手术组心肌纤维排列整齐，心肌细胞结构完整，细胞核及线粒体形态和数量正常；与假手术组相比，缺血再灌注组可见心肌肌纤维溶解、断裂甚至坏死，有明显肿胀，线粒体嵴突紊乱及空泡化严重，而且可见自噬小泡，有较多自噬体形成。与缺血在再灌注组相比，SIK2抑制剂组大鼠心肌细胞肿胀、空泡化减轻，坏死灶减轻，而且自噬体形成较少（图7）。

3 讨论

近年来，越来越多的研究表明自噬广泛参与心肌缺血再灌注损伤的发生发展，因此调控自噬成为减轻心肌缺血再灌注损伤的一个潜在治疗靶点。自噬是心肌缺血再灌注损伤的重要分子机制，参与自噬的信号转导分子和通路的调控非常复杂。AMPK-mTORUlk1 通路是调节自噬的重要信号通路，AMPK在缺血再灌注过程中被激活。AMPK激活可导致mTOR失活和ULK1（Ser757）激活，从而促进自噬。SIK2是AMPK亚家族成员之一，已有研究表明SIK2在缺血性疾病的发生发展中发挥重要的作用，然而其影响缺血性疾病进展的具体机制仍然是未知的。所以本研究探究在心肌缺血再灌注损伤过程中，SIK2是否通过调控细胞自噬，影响心肌组织的损伤。

本研究通过注射博舒替尼调控SIK2表达水平，建立大鼠心梗模型，继而观察下游靶基因的表达水平变化趋势以及心脏损伤的情况，检测自噬相关蛋白来判断SIK2与自噬之间的机制。实验结果表明，大鼠心肌缺血再灌注后，心肌细胞发生损伤，LVEF、FS 值下降，LC3-Ⅱ/LC3-I、Beclin-1蛋白表达增多，p62蛋白表达减少，心肌组织SIK2蛋白表达水平增加；上述结果说明缺血再灌注可以诱发心肌细胞发生过度自噬，从而加重大鼠心肌缺血再灌注损伤，表现为病理损伤加重，心脏射血分数降低。为了探究大鼠心肌缺血再灌注过程中自噬水平增加是否和SIK2有关，使用SIK2的抑制剂来验证，发现与模型组相比SIK2抑制剂组心肌细胞损伤减轻，LVEF、FS值升高，LC3-Ⅱ/LC3-I、Beclin-1蛋白表达减少，p62蛋白表达增多，结果说明心肌缺血再灌注损伤过程中SIK2的表达上调可以促进自噬，使用SIK2抑制剂可抑制心肌异常自噬减轻心肌缺血再灌注损伤。此前大量研究表明，心肌缺血再灌注会导致细胞内产生大量ROS，从而引发自噬，然而自噬引起的结局有所区别，有的研究认为促进自噬可加重损伤［，有的研究认为促进自噬可以减轻损伤。虽然许多研究中存在一些相悖的结果，但是大家的共同认识是，自噬的短期和中度激活可能会通过降解功能失调或受损的蛋白质和细胞器来促进细胞存活，从而产生有益的影响，而自噬的持续升高可能会促进细胞死亡。为了进一步探究SIK2是通过何种机制调控自噬水平，研究中检测了mTOR-Ulk1相关通路蛋白，结果表明，大鼠心肌缺血再灌注后心肌组织SIK2、p-ULK1（Ser757）蛋白表达增多，p-mTOR蛋白表达减少；而在SIK2抑制剂组SIK2、p-ULK1（Ser757）蛋白表达减少，p-mTOR蛋白表达增多。这些结果提示我们在心肌缺血再灌注损伤过程中，SIK2通过调控mTOR-ULK1来影响自噬水平。

综上所述，在大鼠心肌再灌注损伤发生过程中，抑制SIK2可以下调mTOR-Ulk1 信号通路，抑制细胞过度自噬，改善大鼠心功能，减少心肌细胞损伤，对心肌缺血再灌损伤起到良好的保护作用。