赵盈涵，李 田，邵鹏帅，孙景宽，许文静，张泽浩

(1 滨州学院 山东省黄河三角洲生态环境重点实验室，山东滨州 256603; 2 山东农业大学 林学院 泰山森林生态系统国家定位观测研究站/黄河下游森林培育国家林业和草原局重点实验室，山东泰安 271018)

黄河三角洲湿地位于山东省北部黄河入海处，具有重要的环境养护功能，在维护生物多样性、净化污染物、调节小气候等方面具有重要作用[1]。然而，近些年由于自然因素及人为活动的影响，湿地土壤的水盐平衡遭到破坏，土壤盐渍化程度不断加大[2]。盐渍化土壤不仅限制了该地区许多植物的正常生长，同时还对土壤中的微生物群落产生重要影响[3]。

微生物被认为是土壤中最重要和最活跃的部分，它通过自身生命活动，可以改变土壤理化特征，在维持土壤生态平衡、促进植物生长方面发挥着重要作用，对促进土壤养分循环和提高生态效率具有积极影响[4]。其中，真菌作为土壤中的主要微生物成分之一，与植物间存在着互惠和共生关系，其不仅可以分解土壤中的有机物质为宿主植物提供养分，还可以通过抵抗土壤中病原体和环境压力来增加植物的抗逆性，在保障植物健康方面发挥着重要作用[5]。植被类型可影响土壤微生物的结构组成、微生物活性以及功能类群[6-7]。特别是“植物-土壤-微生物”作用最为激烈的根际区域，不同植物种类，由于其生理代谢机理不同所导致的根系分泌物种类的差异，使得根际与周围土壤的理化性质产生不同，从而对根际土壤真菌群落多样性和结构等产生影响[8-11]。研究发现，不同植物种类与其作用的特定菌群存在差异，而不同真菌在促进植物生长或在抵抗不利环境时所发挥的生态作用也不尽相同[12-13]。因此研究和探讨不同植物种类根际土壤真菌群落的组成与特征，可为有益真菌类群的挖掘以及某一地区的生态保护提供参考。

黄河三角洲地区植被类型以盐生植物为主，其中拒盐植物芦苇(Phragmitescommunis)、聚盐植物盐地碱蓬(Suaedasalsa)、泌盐植物獐毛 (Aeluropussinensis)是该地区具有代表性且面积分布较广的不同类型盐生植物。研究表明，盐生植物可通过改善土壤微生物活动对生态系统健康以及维持生态平衡发挥重要作用[14-15]。目前，关于单一种类盐生植物土壤微生物群落的研究相对较多，其中包括芦苇根系土壤AM真菌的空间分布[16]、不同生境条件下芦苇根际土壤微生物群落特征[17-18]以及盐地碱蓬根际土壤细菌群落特征[19]等研究。近年来，关于不同植被类型的土壤微生物群落特征以及植物群落和环境因子对土壤微生物影响的研究也越来越受到重视。Zhao等[20]揭示了碱蓬根系微生物与土壤理化性质的关系，Zhang等[21]发现土壤养分是影响海岸带湿地不同植物群落土壤微生物多样性的重要因素。此外，赵娇等[22]、Cao等[23]对黄河三角洲部分盐生植物的根际土壤细菌多样性进行了研究。上述研究可为开展该地区盐生植物根际和非根际土壤真菌研究提供一定参考，但目前从不同类型盐生植物的角度对植物根际和非根际土壤真菌群落特征变化的研究报道不多。本研究以黄河三角洲地区芦苇、盐地碱蓬、獐毛3种不同类型盐生植物为对象，提取根际与非根际土壤总DNA，经PCR扩增与纯化，并通过高通量测序平台对土壤真菌群落多样性和群落结构进行分析，揭示3种不同类型盐生植物根际与非根际土壤真菌群落结构和丰度特征，分析土壤真菌群落与土壤环境因子的内在联系。研究结果可丰富对黄河三角洲滨海盐碱地区不同类型盐生植物根际真菌群落特征的认识，为盐渍化土壤修复提供必要的理论依据。

1 材料和方法

1.1 采样区概况及样品采集

采样地位于山东省东营市河口区(N37°35′至38°12′，E118°33′至119°20′)。该地区土壤为盐碱土，植被类型以盐生植物为主。选择3种不同类型盐生植物——芦苇、盐地碱蓬、獐毛群落各3个，每个植物群落设置3个样点，且每两个样点之间的距离不小于20 m，每个样点划分出1 m×1 m的区域样方，每个样方内选择生长状况相近且无病虫害感染的健康植株，用取样铲对0～20 cm深度的土层进行采挖，将植株主体带土挖出后，用小铲取其根系周围土壤，记为非根际土；采用抖根法收集植物根际土。去除杂物后，将同一样方内的根际土和非根际土分别混合均匀，四分法分成两份。一份放入自封袋中，自然风干后用于测定土壤理化性质，另一份放置在50 mL 已灭菌的离心管中，于低温下带回实验室，-80 ℃保存，用于土壤微生物测序。

1.2 DNA提取和PCR扩增

每种样品土壤称取0.5 g用Omega的“Soil DNA Kit”试剂盒提取DNA，采用NanoDrop2000检测DNA纯度和浓度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。对ITS1基因片段进行扩增处理。将每个样本的3个PCR进行重复后混合，得到的产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，后将得到的产物纯化。Miseq文库构建后，进行高通量测序和DNA数据处理，将得到的有效OTU聚类注释进行下一步分析。

1.3 数据分析

SPSS 20.0对真菌群落α多样性、优势真菌丰度以及不同土壤中总碳(TC)、总氮(TN)、有效磷(aP)含量之和进行ANOVA单因素方差分析(One-way analysis)，并计算平均数和标准误差。用独立T检验对根际和非根际土壤理化性质指标进行比较分析，Origin Pro 9.0进行柱状图和箱线图的绘制。将有效的OTU聚类注释信息借助https://bioincloud.tech/#/平台分析并绘制土壤真菌群落花瓣图、PCoA和NMDS排列图，采用Canoco 5软件分析土壤真菌群落与土壤理化性质之间的关系，并借助上述平台绘制关系热图和冗余分析图。

2 结果与分析

2.1 测序饱和度分析

图1表明，3种不同类型盐生植物根际与非根际的土壤样品的稀释曲线均已趋于平坦，即各样本的OTU覆盖度已饱和，表明真菌测序数据量合理。

2.2 不同盐生植物根际和非根际土壤真菌多样性分析

由图2可知，3种不同类型盐生植物根际与非根际土壤中，共有的OTU数量为17。芦苇、盐地碱蓬、獐毛根际土中分别注释到各自特有的OTU数量表现为獐毛>芦苇>盐地碱蓬。对3种不同类型盐生植物根际与非根际土壤的真菌丰富度和多样性进行对比，其OTU注释、Chao1、Faith指数均表现为根际土显著高于非根际土。不同盐生植物之间，真菌群落多样性和丰富度存在差异。根际真菌丰富度排序为：獐毛>盐地碱蓬=芦苇，獐毛根际土OTU注释、Chao1、Faith指数均显著大于其他2种盐生植物(P<0.05)；不同盐生植物非根际土中真菌多样性和丰富度特征与根际土中差异特征相一致，其中獐毛Shannon和Simpson指数显著高于芦苇(P<0.05)(图3)。

2.3 真菌群落结构分析

2.3.1 群落物种组成及优势菌属差异性比较本实验共分离到1门3属，球囊菌门(Glomeromycota)为优势门，盾巨胞囊霉属(Scutellospora)为优势属(图4)。球囊菌门中共注释到3个不同属，其中优势属盾巨孢囊霉属约占球囊菌门总丰度的90.63%(表1)。对相同植物根际与非根际土壤中球囊菌门相对丰度分析发现(图5)，盐地碱蓬表现为根际显著小于非根际，獐毛则为根际显著大于非根际，而芦苇在根际与非根际间差异不显著。不同盐生植物根际土壤球囊菌门丰度表现为獐毛与盐地碱蓬差异不显著，但显著高于芦苇。盾巨孢囊霉属在相同盐生植物根际与非根际土壤之间，以及不同盐生植物根际土壤之间未见显著差异。

2.3.2 群落间结构差异性比较基于Bray-Curtis相似性系数对3种不同类型盐生植物根际与非根际土壤真菌群落数据进行PCoA分析(图6)，3个轴共解释了真菌群落组成差异的33.08%。由排序图中距离远近可知，芦苇和盐地碱蓬2种植物根际土真菌群落结构组成相似程度较高，獐毛根际土与其他2种植物根际土壤真菌群落差异大。此外，獐毛根际与非根际土在排序图上聚在一起，表明獐毛根际与非根际土壤中真菌群落结构差异较小。由NMDS分析可知，芦苇和盐地碱蓬非根际土壤样品在排序图中距离其他样品较远，表明芦苇和盐地碱蓬非根际土壤与其他样品土壤之间真菌群落结构差异较大。

2.4 土壤真菌类群与理化性质的相关性

2.4.1 土壤理化性质分析图7表明，相对于非根际土，盐生植物根际土pH、TC、TN、aP的平均数值均增高，含盐量和有机碳(OC)含量均降低。其中植物根际与非根际土壤的pH、TC、TN、OC、aP均达显著差异水平(P<0.05)。

表1 土壤真菌群落结构类别表

2.4.2 真菌类群与土壤理化性质的相关性土壤理化性质与真菌群落多样性和丰富度关系热图(图8)表明，TC、TN、pH与土壤真菌群落丰富度和多样性呈显著正相关，aP与Chao 1丰富度和注释OTU数量呈显著正相关；土壤盐分含量与Faith指数呈显著负相关。

RDA分析结果(图9)显示，其第一轴和第二轴分别解释了真菌群落组成的25.55%和17.46%的变异；3种不同类型盐生植物真菌群落受土壤盐分和总氮含量的影响较强。土壤样本排序集中在x的负半轴，pH、TC在第一象限，与在第四象限的TC、aP、OC呈良好的正相关关系，盐分位于第四象限，与第一象限的pH和TN呈负相关。土壤理化性质与优势菌门的相关性分析表明，球囊菌门与pH、TC、TN、aP、OC呈正相关，与土壤盐分含量呈负相关。

3 讨 论

3.1 不同类型盐生植物根际和非根际土壤真菌群落结构分析

本研究中，球囊菌门为3种不同类型盐生植物根际与非根际土壤中的优势门。该菌门通常可增强植物应对盐胁迫的能力[24]。本研究中的优势属为盾巨孢囊霉属，这与其他有关黄河三角洲真菌多样性研究得出的子囊菌门和毛壳菌属/焦孢壳属相对丰度最高的结论不同[25-27]，这是因为植物根际微环境因子的差异会对微生物多样性产生显著影响[28]。另外，与其他关于盐生植物根际真菌多样性研究相比，本研究中发现的优势菌属并不相同且种类较少。如艾比湖湿地盐生植物根际土壤真菌的主要优势真菌门属为子囊菌门和链格孢霉属，南疆盐生植物根际真菌的共有优势属可达4种(镰孢菌属、支顶孢属、曲霉属和青霉菌属)[29-30]。Suresh等[31]对土壤中优势菌属的相关论断中指出，大部分研究中球囊菌属被认为是绝对优势属，但也存在个例，如在砂质土壤中存在巨孢囊霉属或盾巨孢囊霉属为优势属的情况[32]，可能因为其菌丝体较为丰富，孢子形成和成熟时间较长，从而对沙质以及营养贫瘠土壤具有一定的适应性。盾巨孢囊霉属属于巨孢囊霉科，为丛枝菌根(AM)真菌重要科之一。该科真菌为内陆少见种，主要分布于沿海沙丘、海岛或近海域的农田及草原中，尤其在山东地区为优势科之一[33]。本研究中的优势属为盾巨孢囊霉属，这一结果正好与黄河三角洲地区的土壤特性相吻合，较好地反映出这一地区的真菌特点。

植物种类是影响土壤真菌群落结构的主要因素之一[34]，由于宿主植物种类的差异，其根系形态以及根系分泌物的复杂性可造就不同的土壤微环境，也会对土壤中微生物的结构造成一定影响[35]。研究表明，植物根系与球囊菌门的真菌之间存在共生关系，两者通过耦合过程在土壤中形成菌丝桥网络，提高宿主植物的抗逆能力[36]，而不同盐生植物根系对真菌具有选择性[37]，因此本研究中3种不同类型盐生植物根际土壤中球囊菌门丰度存在差异，且芦苇(拒盐植物)根际真菌多样性略低于盐地碱蓬(聚盐植物)根际，这与南疆芦苇根际土壤真菌群落多样性低于盐爪爪(聚盐植物)根际的结果相一致[30]。

3.2 不同类型盐生植物根际和非根际土壤真菌群落多样性与土壤因子的关系

在各种非生物胁迫下，植物根际微区域会发生复杂的反应来减少根际养分的损失，根际土壤真菌可以促进土壤腐殖质的形成与分解，对提高宿主植物抗逆性、促进植物生长发育等方面具有重要作用[38-39]。本研究中，植物根际与非根际土壤养分含量等理化性质均存在明显差异，根际土壤养分含量显著高于非根际土壤，表明3种不同类型盐生植物根际土壤出现明显的养分富集现象。这是由于植物根系可以不断地从外界环境中吸取养分，使养分在根际区域沉淀[40]；另一方面通过植物根系分泌物的作用，根际微域养分的含量及分布产生一系列的复杂变化，使得根际土壤中微生物的活性增强，养分转化速率也因此提高[41]。3种不同类型盐生植物各自根际与非根际土壤相比，盐地碱蓬和獐毛根际对土壤养分的富集能力显著强于芦苇，说明这2种类型盐生植物在适应盐碱地区环境过程中，需要更多的营养物质来满足其自身生长发育的需要。这与3种不同类型盐生植物的耐盐生理特性正相吻合，即聚盐和泌盐植物对盐分的积累和分泌过程伴随着养分的摄入，而拒盐植物芦苇在防止盐分吸收的同时会阻止养分的吸收[42]。

土壤环境因子对土壤真菌群落多样性和丰富度有重要影响[43-44]，土壤养分含量是影响土壤真菌群落多样性与丰富度的主要驱动因子。热图分析表明TC、TN、aP、pH与土壤真菌群落多样性和丰富度之间呈正相关，这与Liang[45]研究结果具有一定的一致性。本研究中盐地碱蓬和獐毛的根际土壤养分含量显著高于非根际土，但芦苇根际土和非根际土中差异并不显著，这表明聚盐植物盐地碱蓬和泌盐植物獐毛在土壤改良方面较拒盐植物芦苇存在一定的优势。植物耐盐方式的不同对土壤肥力产生了不同程度的影响，而土壤肥力又会影响土壤微生物的结构[46]。研究表明土壤肥力的增加有利于真菌的生长[47]，而球囊菌的代谢产物在生态系统碳汇、土壤质地和土壤肥力提升方面发挥着重要作用[48]。依据獐毛根际土中球囊菌门丰度及根际土壤养分含量的特点，说明獐毛根际与球囊菌门真菌间形成了良好的互惠关系。

本研究表明，土壤盐分是影响黄河三角洲地区土壤真菌群落多样性和丰富度的重要因子，两者之间存在负相关关系，这与袁钟鸣等[49]对苏北泥质海岸带土壤研究结果相同，也进一步说明了盐分对海岸带湿地土壤微生物多样性的限制性作用。本研究中pH与土壤真菌群落多样性和丰富度呈正相关，这与杨春雪等[50]对松嫩盐碱草地的研究结果相一致，但与李雪静等[51]对荒漠和草原土壤真菌多样性测定分析结果相反，这表明相对于荒漠和草原地区，盐碱地区的土壤真菌对pH值的适应范围可能更高。植物凋落物是土壤有机碳的主要来源，不同类型植被下土壤有机碳来源和含量存在差异[52]。本研究中，土壤有机碳含量与真菌群落多样性指数呈正相关，与真菌群落丰富度指数呈负相关。研究表明，有机碳含量对微生物多样性和丰度有着直接影响，是土壤真菌多样性的主要影响因素[53-54]。土壤有机碳含量对土壤真菌多样性起到促进的原因在于很多真菌在土壤中具有腐生性，而土壤有机碳含量的增加有助于腐生性真菌的生存与繁衍，如隶属于球囊菌门的丛枝菌根真菌通过分解植物残体和有机质在获取自身所需碳源的同时，还可改善植物根际的微环境，从而对土壤真菌群落多样性的增加产生影响[55]。

4 结 论

黄河三角洲地区3种不同类型盐生植物根际土壤真菌群落丰富度显著大于各自非根际土，獐毛根际土壤真菌群落丰富度显著大于芦苇和盐地碱蓬的根际土；球囊菌门为绝对优势门，獐毛根际土中该菌门丰度显著高于芦苇，与盐地碱蓬差异不显著；优势属盾巨孢囊霉属在不同盐生植物根际土之间无显著差异。群落间结构差异性比较表明，芦苇和盐地碱蓬非根际土壤真菌群落间的相似性最大，同时与其他样品土壤之间真菌群落结构差异较大。土壤真菌多样性和丰富度与土壤TC、TN、aP、pH呈正相关，与土壤盐分含量呈负相关；球囊菌门丰度与土壤TC、TN、aP、OC、pH呈正相关，与盐分呈负相关。不同盐生植物根际养分富集程度不同，盐地碱蓬和獐毛对土壤养分的富集能力显著强于芦苇。