江帆 刘宁 翟鑫 管频 董霄

糖尿病性心肌病是由糖尿病患者引起的一种并发症，且能够引发心力衰竭、心律失常和休克，严重时可导致猝死，也是糖尿病患者死亡率较高的原因之一[1,2]。糖尿病性心肌病的发病机制受多种因素的制约和影响，心肌细胞凋亡、氧化应激是诱导糖尿病性心肌病的主要因素[3,4]。因此，寻找糖尿病性心肌病的治疗和诊断具有重要作用。长链非编码RNA是一类超过200个核苷酸的非编码RNA，不能够参与编码蛋白的合成，与心血管性疾病的发展密切相关[5]。Liu等[6]研究结果显示，LINC00528在心肌梗死模型细胞中表达上调，LINC00528通过调控miR-143-3p/COX-2轴抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，但是对高糖诱导心肌细胞的研究机制尚不明确。核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号通路是细胞氧化应激的经典通路[7]，有研究发现，柚皮素能够通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路减缓糖尿病小鼠的心肌细胞的凋亡、炎性反应和氧化损伤[8]。本研究通过高糖诱导心肌细胞建立细胞损伤模型，探讨LINC00528是否能够通过调控Nrf2/HO-1信号通路影响高糖诱导心肌细胞凋亡和氧化应激。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 H9C2心肌细胞购买于南京凯基生物；胎牛血清、高糖DMEM培养基购买于美国Gibco公司；葡萄糖购买于美国Sigma公司；si-NC、si-LINC00528、pcDNA、Nrf2和引物购买于上海吉玛公司；Lipofectamine 2000试剂盒购买于美国Invitrogen公司；Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购买于北京于天根生化公司；MTT试剂盒、凋亡试剂盒购买于上海碧云天生物；Bcl-2抗体、Bax抗体、Nrf2抗体、HO-1抗体、NQO1抗体和GAPDH抗体购买于美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购买于北京中杉金桥公司；MDA试剂盒和SOD试剂盒购买于南京建成生物。

1.2 细胞培养与分组 取出冷冻的H9C2心肌细胞快速解冻后，在含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基内孵育，置于37℃、5% CO2密闭恒温培养箱中培养。H9C2心肌细胞生长至对数生长期时，进行消化传代培养。收集2～3代较为稳定的H9C2心肌细接种至96孔板内(1×105个/ml)，将细胞分组，分比为：Con组：细胞正常培养，加入5.5 mmol/L葡萄糖处理细胞；HG组：加入30 mmol/L葡萄糖处理细胞，HG+si-NC组：转染si-NC后进行高糖处理细胞；HG+si-LINC00528组：转染si-LINC00528后进行高糖处理细胞；HG+si-LINC0052+pcDNA组：共转染si-LINC0052和pcDNA后进行高糖处理细胞；HG+si-LINC00528+Nrf2组：共转染si-LINC00528和Nrf2后进行高糖处理细胞。细胞进行转染时按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行操作。

1.3 qRT-PCR检测LINC00528的表达 收集Con组、HG组、HG+si-NC组、HG+si-LINC00528组的H9C2心肌细，按照Trizol法提取各组细胞的总RNA后，在紫外分光度计进行检测定量RNA浓度和纯度。将RNA按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA模板，在荧光定量PCR试剂盒说明书下进行PCR扩增。LINC00528正向引物为：5’-AGCGTCCTTGAGGAGTCCAGTTC-3’，反向引物为：5’-CAAGCACAGTCACGTTCTGAGGTC-3’；GAPDH正向引物为：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’，反向引物为：5’-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3’。以GAPDH作为内参，通过2-ΔΔCt法计算LINC00528的表达。

1.4 MTT检测细胞活力 收集H9C2心肌细胞，取100 μl细胞悬液铺在96孔板内，密度为1×103个/孔，在密闭恒温培养箱内培养48 h，在每孔加入20 μl的MTT试剂，然后继续培养4 h，并加入150 μl的DMSO试剂，带结晶充分溶解后，在酶标仪490 nm处检测细胞吸光度，计算细胞活力。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组H9C2心肌细胞，48 h加入预冷的缓冲液清洗2次，加入binding buffer用于制备细胞悬液，取100 μl的细胞悬液、及5 μl Annexin V-FITC和PI试剂混匀，然后在暗处室温下反应15 min，置于流式细胞仪上检测细胞的凋亡率。

1.6 Western blot检测Bcl-2、Bax和Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白的表达 收集各组H9C2心肌细胞，加入RIPA裂解液后提取各组细胞的总蛋白，检测定量各组总蛋白浓度和纯度。在每孔上样至SDS-PAGE凝胶孔内处理分离，迅速转移在PVDF膜上，并封闭培养2 h，加入Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、NQO1和GAPDH稀释的抗体，4℃过夜孵育，加入稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育2 h，加入化学发光试剂，在暗处进行曝光，在凝胶成像系统下扫描蛋白条带，以GAPDH为内参，计算分析目的蛋白的表达。

1.7 ELISA检测MDA含量和SOD活性 收集各组H9C2心肌细胞，1 000 r/min离心10 min后收集细上清液，取200 μl按照MDA试剂盒和SOD试剂盒说明书步骤，检测各组细胞中MDA含量和SOD活性。

2 结果

2.1 LINC00528在高糖诱导心肌细胞中的表达 qRT-PCR结果显示，与Con组比较，HG组中LINC00528表达显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 LINC00528在高糖诱导的心肌细胞的表达

2.2 抑制LINC00528对高糖诱导的心肌细胞活力和凋亡的影响 与Con组比较，HG组LINC00528表达、细胞凋亡率和Bax蛋白表达升高(P<0.05)，细胞活力、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)；与HG+si-NC组比较，HG+si-LINC00528组LINC00528表达、细胞凋亡率和Bax蛋白表达降低(P<0.05)，细胞活力、Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图1，表2。

图1 抑制LINC00528对高糖诱导的心肌细胞活力和凋亡的影响；A 细胞凋亡率；B 凋亡相关蛋白

表2 抑制LINC00528对高糖诱导的心肌细胞活力和凋亡的影响

2.3 抑制LINC00528对高糖诱导的心肌细胞氧化应激的影响 与Con组比较，HG组的MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD活性显著降低(P<0.05)；HG+si-NC组比较，HG+si-LINC00528组MDA含量显著降低(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 抑制LINC00528对高糖诱导的心肌细胞氧化应激的影响

2.4 LINC00528通过调控Nrf2/HO-1信号通路蛋白的表达 与Con组比较，HG组的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与HG+si-NC组比较，HG+si-LINC00528组的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图2，表4。

表4 LINC00528通过调控Nrf2/HO-1信号通路蛋白的表达

图2 LINC00528通过调控Nrf2/HO-1信号通路蛋白的表达

2.5 LINC00528通过调控Nrf2/HO-1信号通路对高糖诱导的心肌细胞活力、凋亡和氧化应激的影响 与HG+si-LINC0052+pcDNA组比较，HG+si-LINC00528+Nrf2组的Nrf2蛋白表达、细胞活力、Bcl-2蛋白表达和SOD活性显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，细胞凋亡率、Bax蛋白表达和MDA含量显著降低(P<0.05)。见表5，图3。

表5 LINC00528通过调控Nrf2/HO-1信号通路对高糖诱导心肌细胞活力、凋亡和氧化应激的影响

图3 LINC00528通过调控Nrf2/HO-1信号通路对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响；A 细胞凋亡率；B 凋亡相关蛋白

3 讨论

糖尿病性心肌病是糖尿病并发症之一，近年糖尿病患者发病率呈上升趋势，其中关于心血管并发症最为严重[9]。长期在高糖环境下能够引起心肌细胞的凋亡、纤维化，导致心肌细胞损伤引起心肌细胞紊乱、心力衰竭等[10]。因此，本研究结果显示，高糖能够抑制细胞活力、SOD活性，促进细胞凋亡率、MDA含量，下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，表明高糖诱导心肌细胞损伤模型成功。lncRNA在糖尿病性心肌病内异常表达，与高糖诱导心肌细胞凋亡和氧化应激密切相关，参与糖尿病性心肌病的发展[11,12]。Yang等[13]研究显示，KCNQ1OT1在高糖诱导的心肌细胞和糖尿病小鼠心脏组织中表达上调，沉默KCNQ1OT1能够减缓高糖诱导心肌细胞凋亡。Wu等[14]研究显示，MALAT1在高糖诱导的心肌细胞中表达上调，MALAT1通过靶向miR-141-3p促进高糖诱导的心肌细胞凋亡。陈婉斐等[15]研究显示，LUCAT1在高糖诱导的心肌细胞中表达上调，利用siRNA技术，发现抑制LUCAT1通过调控miR-204-3p能够减缓高糖诱导的心肌细胞凋亡、氧化应激。HAGLROS在高糖诱导的心肌细胞表达上调，抑制HAGLROS通过上调miR-20a-5p并激活PI3K/AKT信号通路减缓高糖诱导的心肌细胞的凋亡[16]。本研究结果显示，高糖诱导心肌细胞后LINC00528表达上调，抑制LINC00528可以降低LINC00528表达、细胞凋亡率、MDA含量，促进细胞活力、SOD活性，上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，说明抑制LINC00528能够减缓高糖诱导的心肌细胞损伤。

Nrf2/HO-1信号通路是较为重要的内源性氧化应激通路，与细胞的抗氧化、抗炎和细胞凋亡等密切相关[17]。Nrf2是抗氧化反应的重要转录因子，可以与keap1形成复合物，当体内发生氧化应激时，能够与抗氧化反应原件相结合，进而启动下游HO-1、NQO1等抗氧化基因的表达，发挥其在机体内的氧化应激反应[18,19]。侯剑飞等[20,21]研究显示，红芪多糖通过激活ERK/Nrf2/HO-1信号通路减缓大鼠心肌细胞的氧化应激损伤。贾强等[22]研究显示，金雀异黄酮通过调节Nrf2/HO-1信号通路减缓糖尿病大鼠的心肌细胞氧化损伤。本研究结果显示，高糖诱导心肌细胞后Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达下调，抑制LINC00528可以上调Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达；说明LINC00528能够调控Nrf2/HO-1信号通路的表达。在心肌细胞转染过表达Nrf2，结果显示，细胞活力、SOD活性受到促进，并抑制细胞凋亡率、MDA含量，上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，说明LINC00528通过激活Nrf2/HO-1信号通路减缓高糖诱导心肌细胞的损伤。

综上所述，LINC00528在高糖诱导心肌细胞中表达上调，抑制LINC00528能够减缓高糖诱导心肌细胞凋亡和氧化损伤，其作用机制可能与Nrf2/HO-1信号通路有关。