卢雯瑩 葛昌斌 曹燕燕 黄杰 乔冀良 张振永 王君 齐双丽 廖平安

摘 要：小麦（Triticum aestivum）是世界三大主粮之一，倒伏严重制约了小麦产量的提高。小麦肉桂醇脱氢酶基因（TaCAD1）是小麦木质素合成的关键基因，小麦体内木质素含量越高，茎秆强度越高，抗倒伏能力随之增强。为了探明小麦肉桂醇脱氢酶基因的生物学功能，对TaCAD1基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明：TaCAD1基因cDNA序列全长1311bp，包含1个长度为1083bp的开放阅读框（ORF），编码360个氨基酸。TaCAD1蛋白等电点（pI）为5.74，分子量为38625.45 Da，其不穩定系数为23.91，属于稳定蛋白质。推导的TaCAD1蛋白为疏水性蛋白，不存在跨膜区，可能位于细胞质内，该蛋白的二级结构元件主要为无规卷曲。TaCAD1蛋白在进化过程中较为保守，与节节麦、大麦、高羊茅、黑麦草、短花药野生稻CAD蛋白的一致性达94.81%。研究结果为进一步探究TaCAD1在小麦抗倒伏过程中的作用及小麦抗倒伏的分子育种提供参考。

关键词：小麦;肉桂醇脱氢酶;木质素;抗倒伏;生物信息学分析

中图分类号 S512 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2022）11-0016-05

Full-length cDNA Sequence and Bioinformatics Analysis of Cinnamyl Alcohol Delivering Enzyme Gene （TaCAD1） in Triticum aestivum

LU Wenying   GE Changbin   CAO Yanyan   HUANG Jie   QIAO Jiliang   ZHANG Zhenyong   WANG Jun

QI Shuangli   LIAO Pingan

（Luohe Academy of Agricultural Science， Luohe 462300， China）

Abstract： Wheat（Triticum aestivum） is one of the world's three major staple foods， and wheat lodging has severely restricted the increase in wheat production. The wheat cinnamyl alcohol dehydrogenase gene （TaCAD1） is a key gene for wheat lignin synthesis. The higher the lignin content in wheat， the higher the stalk strength and the enhanced lodging resistance. In order to ascertain the biological function of wheat cinnamyl alcohol dehydrogenase gene， this paper conducts bioinformatics analysis on the amino acid sequence encoded by TaCAD1 gene. Bioinformatics analysis showed that the full-length cDNA sequence of TaCAD1 was 1311 bp， including an open reading frame （ORF） of 1083 bp in length， encoding 360 amino acids. The isoelectric point （pI） of TaCAD1 protein is 5.74， the molecular weight is 38，625.45 Da， and its instability coefficient is 23.91， which is a stable protein. The deduced TaCAD1 protein is a hydrophobic protein， there is no transmembrane region， and may be located in the cytoplasm. The secondary structure of the protein is mainly random coils. The TaCAD1 protein is relatively conservative in the evolutionary process， and it is 94.81% consistent with the CAD protein of Jiejie wheat， barley， tall fescue， ryegrass， and short anther wild rice. This study provides new ideas for further exploring the role of TaCAD1 in the process of wheat lodging resistance and molecular breeding of wheat lodging resistance.

Key words： Wheat; Cinnamyl alcohol dehydrogenase; Lignin; Lodging resistance; Bioinformatics Analysis

小麦作为三大主要粮食作物之一，在世界广泛种植，其播种面积和产量在各类粮食作物中均居首位，目前世界1/3的人口是以小麦为主食。我国是重要的小麦生产大国之一，小麦产量、消费量居于世界前列。近年来，我国小麦生产发展迅速，但倒伏与高产间的矛盾日益突出。小麦发生倒伏的主要位置是茎秆[1]，严重倒伏的小麦种植区域可能导致产量减少80%左右[2]。

木质素是一类复杂的酚类聚合体，在植物体内所占比重较高，是构成植物次生细胞壁的重要成分之一。木质素能够通过自身的交织作用加厚细胞壁，进而加强植物茎秆强度，起到抗压作用[3]。木质素在小麦体内含量的多少与小麦茎秆的抗倒伏特性存在一定关系[4]。Welton的研究表明，若减弱小麦茎秆的机械强度，小麦倒伏容易发生，且小麦体中木质素含量随之降低[5];若小麦茎秆机械强度增加，小麦抗倒伏能力增强，小麦体中木质素含量相应升高[6]。

木质素的沉积主要发生在细胞生长完成、次生壁加厚的特定时期[7]。其在植物体内的生物合成过程复杂[8]，大致分为三部分：莽草酸途径、苯丙烷途径和木质素的特异合成途径[9]。肉桂醇脱氨酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）催化肉桂醛还原成相应的肉桂醇，是木质素合成途径最后一步的关键酶[10]。Ma[11]从小麦中分离出1个可以编码CAD基因的cDNA——TaCAD1，TaCAD2和TaCAD4可能不具有酶活性[12]。TaCAD1基因在茎秆中高表达，叶片中表达量次之，根中几乎不表达;抗倒伏小麦品种mRNA的表达丰度、酶活性均高于不抗倒伏的小麦品种[11]。

1 材料和方法

1.1 小麦肉桂醇脱氢酶基因的cDNA序列搜索 搜索GenBank中注册的小麦CAD基因（TaCAD1）的全长cDNA序列（GU563724），将其开放阅读框翻译成相应的氨基酸序列用于后续生物信息学分析。

1.2 TaCAD1蛋白的生物信息学分析 使用ExPASy服务器中ProtParam在线软件（http：//web.expasy.org/protparam/）得到小麦肉桂醇脱氢酶TaCAD1的等电点、不稳定系数、平均疏水性和分子量等理化性质;ProtScale在线软件（http：//web.expasy.org/protscale/）预测氨基酸序列亲/疏水性预测图;通过SignalP-5.0软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）对小麦肉桂醇脱氢酶进行相关信号肽的预测与分析;应用在线软件工具PSORT II Prediction（https：//psort.hgc.jp/form2.html）预测亚细胞定位;用ExPASy服务器中TMHMM Server v. 2.0在线工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）获得小麦肉桂醇脱氢酶蛋白的跨膜结构域;使用NPS软件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）预测蛋白质二级结构。利用DNAMAN 8.0软件，对TaCAD1蛋白的氨基酸序列与其他同源物种进行同源性比对分析，在MEGA 6.0软件的支持下，构建TaCAD1与不同植物CAD蛋白序列的系统进化树。运用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）在线软件工具，对TaCAD1蛋白进行三级结构建模。在NCBI官方网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中能够预测保守结构域的数据库（Conserved Domain Database，CDD）的帮助下，分析TaCAD1蛋白序列是否具有典型的CAD基因家族蛋白的保守结构域。

2 结果与分析

2.1 小麦TaCAD1基因cDNA序列的ORF 小麦TaCAD1基因的cDNA序列全长1311 bp，包含1个长度为1083bp的开放阅读框（ORF），可编码360个氨基酸（图1）。

2.2 TaCAD1蛋白一级结构及理化性质 用ExPASy服务器中ProtParam得到TaCAD1蛋白序列的物理化学性质，见表1。表1显示，小麦肉桂醇脱氢酶编码360个氨基酸，分子量为38625.45 Da;等电点为5.74，判断为碱性蛋白;不稳定系数Ⅱ为23.91，小于40，分类为稳定蛋白。该蛋白质中共包含20种氨基酸，含量最高的为缬氨酸（Val），所占比例为13.1%。

用ExPASy服务器中ProtScale在线软件获得氨基酸序列亲/疏水性预测图（图5），结果表明TaCAD1蛋白的亲水性平均系数（GRAVY）为0.011，多肽链中具有最低分值（-2.211）的是位于第216位的赖氨酸（K），亲水性最强;具有最高分值（2.700）的是位于第95位的甘氨酸（G），疏水性最强。疏水氨基酸（正值）稍多于亲水氨基酸（负值），推测小麦肉桂醇脱氢酶基因编码氨基酸序列对应的蛋白质为疏水性蛋白。

2.3 TaCAD1蛋白亚细胞定位 使用应用在线软件工具PSORT II Prediction预测TaCAD1蛋白亚细胞定位的结果（表2）显示：该蛋白质定位于细胞质的概率为0565，位于细胞核的概率为0.130，位于线粒体基质的概率为0.130。因此，推断该蛋白存在于细胞质的可能性最大。

2.4 TaCAD1蛋白的信号肽和跨膜结构域分析 应用SignalP-5.0软件预测小麦肉桂醇脱氢酶基因所编码的蛋白质的信号肽，结果如图3，该蛋白信号肽预测值为0.037，表明TaCAD1蛋白不存在信号肽区域，推测其可能为非分泌型蛋白。

TMHMM Serverv. 2.0在线工具输入氨基酸序列預测小麦肉桂醇脱氢酶蛋白的跨膜结构域的结果显示（图4），跨膜结构域预测图无峰值，证明TaCAD1蛋白不存在跨膜结构域，可能为非跨膜蛋白，且主要位于膜外区域。综合上述信号肽分析和跨膜结构域分析，推测该蛋白既不属于分泌蛋白，也不能认为是膜蛋白。该结论与亚细胞定位分析所显示的TaCAD1蛋白可能位于细胞质中的预测结果相吻合。

2.5 TaCAD1蛋白的二级结构预测 使用在线软件NPS预测蛋白质的二级结构（表3，图5），结果显示TaCAD1主要由α-螺旋（Alpha helix）、延伸链（Extended strand）、无规卷曲（Random coil）3种结构组成，其中无规卷曲是TaCAD1蛋白二级结构最主要的结构元件，占53.61%;α-螺旋和延伸链分别占23.33%和23.06%，无β-折叠。

2.6 TaCAD1蛋白三维结构预测 使用SWISS-MODEL在线软件工具对TaCAD1蛋白进行三级结构建模，在RasTop软件下对以上模型做相应处理，构建蛋白质三维结构图如图6。由三维结构图不难发现，TaCAD1蛋白主要由无规卷曲构成，这与前面对TaCAD1蛋白二级结构所预测的结果一致。

2.7 TaCAD1蛋白的保守结构域和功能预测 对TaCAD1蛋白进行Protein Blast分析以判断其可能存在的保守结构域，结果见图7。TaCAD1蛋白属PLN02514超基因家族，含有PLN02514保守结构域。

2.8 TaCAD1蛋白同源性分析与系统进化树构建 应用DNAMAN 8.0软件，对TaCAD1与节节麦、大麦、高羊茅、黑麦草、短花药野生稻CAD的蛋白序列进行同源性分析，结果（图8）显示，TaCAD1蛋白与节节麦、大麦、高羊茅、黑麦草、短花药野生稻的CAD氨基酸序列一致性高达94.81%。

利用Blastp同源搜索，构建了TaCAD1与不同植物CAD蛋白序列的系统进化树，TaCAD1与高羊茅、黑麦草CAD编码蛋白的同源性最高（图9）。

3 结论与讨论

肉桂醇脱氢酶是小麦茎秆木质素生物合成途径最后一步反应的关键酶之一。本研究通过NCBI搜索得到1个小麦肉桂醇脱氢酶基因（TaCAD1）cDNA序列，该序列全长1311 bp，包含1个长度为1083bp的开放阅读框，编码氨基酸个数为360个。木质素是一种通过β-O-4、β-β、β-5、5-5等共价键连接形成的网状结构高分子聚合物，甲氧基是木质素结构中特征官能团之一，因此其理化性質比较稳定。小麦TaCAD1推导蛋白的不稳定系数为23.91，是稳定蛋白，符合木质素理化性质稳定这一特性。TaCAD1蛋白分子量为38625.45 Da，等电点（pI）为5.74。此外，TaCAD1蛋白在进化过程中较为保守，与节节麦、大麦、高羊茅、黑麦草、短花药野生稻CAD蛋白的一致性达94.81%。系统进化树结果表明，TaCAD1蛋白与高羊茅和黑麦草CAD蛋白同源性最高。本研究获得小麦肉桂醇脱氢酶（TaCAD1）全长cDNA序列及蛋白功能预测结果，将为下一步验证该基因功能奠定了理论基础，也为进一步深入研究TaCAD1基因在小麦抗倒伏育种中的作用提供重要参考。

参考文献

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基金项目：国家小麦产业技术体系漯河综合试验站建设项目（CARS-3-2-26）。

作者简介：卢雯瑩（1994—），女，河南漯河人，研究实习员，研究方向：小麦遗传育种。

通讯作者：廖平安（1964—），男，湖北鄂州人，研究员，研究方向：小麦育种。  收稿日期：2021-12-14