刘岩，刘兵，李斯琪，李红帅，徐丽斯，刘艳霞

国家老年疾病临床研究中心 北部战区总医院老年医学中心干二科，沈阳 110016

神经酰胺是真核细胞中存在的一类复杂多样的高度疏水性脂质，它不仅是细胞膜的重要组成部分，而且作为脂质第二信使参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等过程，同时也是鞘磷脂信号途径的重要中间产物[1-3]。研究发现，神经酰胺与多种心血管危险因素关系密切，尤其在动脉粥样硬化的发生、发展过程中有着重要的作用[4-5]，测定生物样本中各种神经酰胺的含量，对研究神经酰胺的生物学效应机制有重要意义[6]。本文采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)的多反应监测模式检测血浆中不同类型神经酰胺含量，并探讨神经酰胺水平与动脉粥样硬化的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年8月1日至2020年7月31日在北部战区总医院体检或入院诊治的动脉粥样硬化患者(AS组)114例，健康对照者(CO组)134例。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：年龄为45～55岁。颈部血管超声测量颈动脉内膜中层厚度(IMT)，并重复测量3次，取平均值。以IMT>1.0 mm，定义为颈动脉内膜中层增厚；以IMT>1.3 mm，定义为颈动脉粥样硬化斑块形成[7]。IMT>1.0 mm入选AS组，IMT≤1.0 mm入选CO组。资料完整且签署知情同意书。排除标准：妊娠期妇女；恶性肿瘤患者；不愿配合者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要仪器及测定指标 超高效液相色谱仪(美国，Waters)；ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD三重四极杆质谱仪(美国，Waters)；CV100-DNA真空离心浓缩仪(中国，北京吉艾姆)。全谱神经酰胺指标包含：Ceramide 16∶0 (Cer 16∶0)、Ceramide 18∶0 (Cer 18∶0)、Ceramide 24∶0(Cer 24∶0)、Ceramide 24∶1(Cer 24∶1)。Cer 16∶0-d7、Cer 18∶0-d7、Cer 24∶0-d7、Cer 24∶1-d7为相应神经酰胺内标。

1.3.2 实验室指标 按统一标准测定体重指数(BMI)、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、血糖、糖化血红蛋白、血尿酸、同型半胱氨酸等指标，以及研究对象合并疾病、合并用药等基线资料。研究对象均空腹采静脉血，应用HPLC-MS检测血液中4种神经酰胺(Cer 16∶0,Cer 18∶0,Cer 24∶0,Cer 24∶1)的浓度。依据检测出的数值进行评分，评分标准[8]见表1，根据总分分级，神经酰胺低水平(0～2分)，神经酰胺中水平(3～6分)和神经酰胺高水平(7～12分)。

表1 UPLC-MS法检测神经酰胺项目及评分标准(μmol/L)

2 结果

2.1 一般情况比较 2组研究对象的性别、年龄、BMI、三酰甘油、血糖、糖化血红蛋白、血尿酸、同型半胱氨酸、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、脑梗死等患病情况，应用口服药物的情况等进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)。AS组患者的总胆固醇水平、低密度脂蛋白胆固醇水平高于CO组患者，高密度脂蛋白胆固醇水平低于CO组患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者一般资料比较

2.2 神经酰胺水平比较 AS组3种神经酰胺水平(Cer 16∶0、Cer 18∶0、Cer 24∶1)及Cer 18∶0/24∶0均较CO组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。2组研究对象Cer 16∶0/24∶0、Cer 24∶1/24∶0比值差异无统计学意义。见表3。

表3 2组患者神经酰胺水平比较[M(P25,P75)]

2.3 神经酰胺风险等级比较 按神经酰胺水平分3个风险等级，2组低、中、高风险等级所占人数比差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组神经酰胺不同风险等级评分人数比较[例(%)]

2.4 相关性分析 应用二元logistic回归分析，对2组研究对象的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇水平进行校正，结果表明神经酰胺是动脉粥样硬化的独立危险因素[P<0.05,OR(神经酰胺中风险)=1.990，OR(神经酰胺高风险)=6.071]。见表5。

表5 动脉粥样硬化与神经酰胺水平的二元logistic回归分析

3 讨论

动脉粥样硬化是心血管疾病较常见的病因之一，也是患者死亡的主要原因之一[9]。鞘脂分子可能通过不同的机制介导动脉粥样硬化的发生和发展。冠心病患者的神经酰胺亚型(Cer 16∶0、Cer 18∶0、Cer 22∶0、Cer 24∶0和Cer 24∶1)与斑块不稳定[10]、不良心血管事件[11]和远期预后[12]相关。患者动脉粥样硬化的发生受年龄、性别、血脂、肥胖等因素影响[13]。本研究中2组研究对象年龄、性别、BMI、血糖、糖化血红蛋白、血尿酸、三酰甘油、同型半胱氨酸、吸烟饮酒史、并发疾病、应用药物等多项指标差异无统计学意义，而总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇等差异有统计学意义(P<0.05)。

目前，神经酰胺的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法和HPLC-MS法。其中HPLC是分离神经酰胺的最主要技术，但前期处理复杂，耗时长，存在灵敏度和分辨率不高的缺陷，增加了实验的难度和误差。而质谱法，虽然灵敏度高、所需样品少且用时较短，但由于可能出现质量数重叠的脂质分子之间的相互干扰，常常导致其检测特异性不佳[19-21]。本研究采用的HPLC-MS技术，是一种通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的专门技术，广泛地应用于各个领域中[22]。在众多的分析测试方法中，质谱法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度的且被广泛应用的方法，在临床研究的应用方面，质谱已成为国际公认的定量分析技术。HPLC-MS可以用于检测多种神经酰胺[23]。

本研究入选人群年龄在45～55岁，对于研究广泛人群的神经酰胺水平仍有一定局限性，有待于进一步加大样本量，并对此人群进行随访，观察未来1～3年心血管事件发生情况，进一步研究神经酰胺水平与动脉硬化及心血管事件的相关性。

综上所述，采用HPLC-MS可同时测定不同类型神经酰胺水平，Cer 16∶0、Cer 18∶0、Cer 24∶1高水平与动脉粥样硬化的发生相关。高神经酰胺水平与动脉粥样硬化的发生呈明显正相关，是动脉粥样硬化的独立危险因素。