刘 玲，张静文，张瑞华，史磊磊，王 晨，韩朝军，史永恒，王 斌，刘继平

(陕西中医药大学, 陕西 咸阳 712000)

糖尿病认知障碍(diabetic cognitive impairment，DCI)是一种以轻度认知功能障碍为主的糖尿病并发症，统计发现2型DCI的发病概率高于1型，且随着病程的发展极易转化为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)[1-3]。同时，高血糖也被认为是AD的重要发病因素之一[4]。但导致2型DCI和AD的发病机制目前还未完全阐明，长期高血糖刺激导致的慢性神经炎症可能是其共同的发病基础[5]。小胶质细胞(microglia，MG)是中枢免疫反应的主要参与者，具有调节炎症和免疫反应等功能，另外其分泌的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等发挥神经保护功能[6]。慢性糖尿病患者脑内小胶质细胞会被激活，分泌大量促炎因子和促氧化物质导致持续性炎症从而危害认知功能[7]。因此调节小胶质细胞活化可能是2型DCI的治疗靶点。

JAK/STAT(Janus kinase /signal transducer and activator of transcription)通路与细胞因子表达密切相关，是调控小胶质细胞活化的关键通路，研究发现酸枣仁汤减少APP/PS1小鼠Aβ积累、减轻神经炎症、改善认知障碍的机制与抑制JAK2/STAT3通路表达有关[8]，但其与2型DCI的关系仍需进一步研究。

QFY是张景岳治疗痴呆的传统名方，研究发现QFY具有神经保护作用，但其机制还未完全阐明[9]。QFY还具有一定抗炎、抗凋亡的作用[10]，所以QFY抗炎机制可能与抑制小胶质细胞活化、发挥修复神经的功能相关。因此，本实验旨在探讨QFY对2型DCI大鼠海马小胶质细胞活化以及对JAK2/STAT3通路变化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物12～24 周SPF级♂SD大鼠103只，体质量(180～220) g，通过成都达硕实验动物有限公司购买，许可证号：SCXK(川)2020-030，于陕西中医药大学中药药理实验室动物房饲养，本研究中动物实验经陕西中医药大学动物伦理委员会批准同意。

1.2 药物与试剂QFY组成为人参6 g，熟地9 g，当归9 g，白术(炒)5 g，炙甘草3 g，酸枣仁6 g，制远志5 g。以上中药饮片均购于咸阳宜家大药房，经陕西中医药大学中药鉴定教研室颜永刚教授鉴定为正品，符合2020版《中国药典》一部相关规定。按照处方比例，十倍水煎煮1 h，收集滤液，残渣加八倍水继续煎煮40 min，过滤后合并滤液，减压浓缩成生药浓度分别为0.43 kg·L-1和0.86 kg·L-1的药液，4 ℃保存。按照1 mL/100 g的体积灌胃。盐酸二甲双胍片(格华止，规格：0.5 g/片，中美上海施贵宝制药有限公司)；链脲佐菌素(Sigma公司)；p-JAK抗体(3776S)、JAK抗体(3230S)、p-STAT3抗体(9145S)、STAT3抗体(9139S)均购于Cell Signaling Technology公司，β-actin抗体(10004156)购自Proteintech公司；Iba-1抗体(GB12105)购自武汉赛维尔生物科技有限公司；羊抗小鼠(BA1050)、羊抗兔(BA1054)、超敏ECL化学发光液(AR1197)均购自武汉博士德生物工程有限公司。ELISA试剂盒TNF-α(ml002859)、IL-6(ml102828)、IL-10(ml002813)和BDNF(ml302829)均购自于上海酶联生物科技有限公司。

1.3 仪器罗氏血糖仪(罗氏诊断产品有限公司)；Morris水迷宫(上海吉量软件科技有限公司)；酶标仪(美国BIOTEK公司)；电泳仪(美国Bio-Rad)；正置荧光显微镜与成像系统(日本尼康)。

1.4 方法

1.4.12型DCI模型建立及分组 造模方法参考[11]，适应性喂养3 d后，随机分组，空白组10只，造模组93只。空白组饲喂普通饲料，造模组给予自制高脂高糖饲料(含基础饲料59%、蔗糖20%、猪油18%、蛋黄3%)喂养4周，禁食16 h，造模组腹腔注射STZ 35 mg·kg-1，空白组注射相同剂量柠檬酸缓冲液。72 h后使用血糖仪检测尾静脉血糖，低于11.1 mmol·L-1的大鼠继续补打1次，取空腹血糖>11.1 mmol·L-1的大鼠继续给予高脂高糖饲料8周，最后1 d测定血糖，剔除未达标大鼠。水迷宫证明造模成功后设立模型组、QFY低(4.3 g·kg-1)、高(8.6 g·kg-1)组、二甲双胍(200 mg·kg-1)组，每组各10只。灌胃4周后d 2禁食不禁水12 h，检测各组血糖。

1.4.2行为学检测 采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力。水迷宫四个象限边缘设置标记，在目标象限设置一水平平台后注水使水面没过平台，确保大鼠无法看见平台，分别从4个象限将大鼠头朝池壁放入水中，训练大鼠寻找平台。连续训练5 d，记录其逃避潜伏期，于d 6撤去平台，记录大鼠在目标象限的穿越次数。

1.4.3样本采集 水迷宫测试结束后d 2麻醉取材。每组随机选择4只大鼠灌注后取出完整大脑置于4%多聚甲醛中，用于病理形态学检测和免疫荧光染色；其余大鼠先腹主动脉采血得到血清，然后迅速脱颈处死取出两侧海马组织，液氮速冻后与血清一同存放于-80 ℃。左侧海马制备成10%组织匀浆用于试剂盒检测，右侧海马进行免疫蛋白印迹分析，全程在冰上操作。

1.4.4观察指标与方法

1.4.4.1尼氏染色 脑组织在4 ℃、4%多聚甲醛溶液中固定24 h，随后乙醇梯度脱水，二甲苯透明、两次浸蜡、常规石蜡包埋、5 μm厚切片进行尼氏染色，400倍显微镜下观察各组大鼠海马CA1区神经元细胞中尼氏小体的含量。

1.4.4.2免疫荧光染色 石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，封闭，加Iba-1一抗(1 ∶3 000)，4 ℃孵育过夜，加二抗。DAPI复染细胞核，淬灭组织自发荧光，封片后镜检扫描，观察并计数海马DG区小胶质细胞标志物Iba-1的表达。DAPI为蓝色荧光，Iba-1为红色荧光。

1.4.4.3血清炎症因子/抑炎因子及海马中BDNF的检测 严格按照ELISA试剂盒说明进行检测TNF-α、IL-6、IL-10和BDNF的含量。

1.4.4.4Western blot 取大鼠右侧海马加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂后，在低温冷冻研磨仪中充分研磨，4 ℃离心取上清液，BCA蛋白定量后，等量蛋白上样，通过SDS-PAGE电泳分离，并转移至0.22 μm PVDF膜上，在TBST中清洗后在5%的脱脂牛奶中封闭1 h,分别加入按比例配好的一抗：p-JAK2(1 ∶1 000)、JAK2(1 ∶1 000)、p-STAT3(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶20 000)，4 ℃过夜；TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗：山羊抗鼠、山羊抗兔室温孵育1 h；TBST洗膜3次,每次10 min，ECL化学发光显影，利用ImageJ计算目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 QFY对2型DCI大鼠干预前后空腹血糖及体质量的影响Tab 1结果表明，4周后，模型组FBG明显高于空白组(P<0.01)，而QFY(8.6 g·kg-1)组和二甲双胍组血糖明显低于模型组(P<0.05)；但各组与四周前相比较发现，模型组以及QFY(4.3 g·kg-1)组血糖均比干预前明显上升(P<0.05，0.05)，而QFY(8.6 g·kg-1)组和二甲双胍组则升高血糖不明显，说明QFY(8.6 g·kg-1)组可以有效抑制2型DCI大鼠体内血糖的持续升高。另外，模型组体质量明显低于空白组(P<0.01)，而各给药组体质量与模型组相差不大；但各组与四周前相比较发现，空白组体质量明显上升(P<0.01)，模型组、二甲双胍组以及QFY(8.6 g·kg-1)组体质量均比4周前明显下降(P<0.01，0.05，0.05),而QFY(4.3 g·kg-1)组则和4周前相差不明显，说明QFY组对抑制2型DCI大鼠体质量持续下降的影响不大。

Tab 2 Effect of QFY on escape latency and number of crossings in type 2 DCI rats / M±IQR，n=9-10)

2.2 QFY对2型DCI大鼠水迷宫成绩的影响随着训练时间的增加，各组大鼠的逃避潜伏期均呈下降趋势。但在d 5时，模型组大鼠逃避潜伏期明显高于空白组(P<0.05)，而QFY低(P<0.01)、高剂量组(P<0.05)和二甲双胍组(P<0.01)的逃避潜伏期均明显低于模型组，这表明模型组的空间学习记忆能力明显受损，而QFY和二甲双胍干预后，学习记忆能力得到改善；撤去平台后，模型组穿越目标平台次数明显低于空白组(P<0.05)，而高剂量组(P<0.01)和二甲双胍组(P<0.05)大鼠穿越平台成绩则明显高于模型组。综上，QFY干预后，2型DCI大鼠的空间学习记忆能力能得到明显提升。

2.3 QFY对2型DCI大鼠海马尼氏染色的影响400×尼氏小体广泛存在于神经元的胞体中，尼氏小体分布均匀、数量多说明神经细胞代谢功能强，若细胞受损，尼氏小体会减少甚至消失。对比空白组大鼠海马CA1区神经元发现，模型组神经元排列稀疏，细胞形态大小不一，部分胞体皱缩，胞内尼氏小体着色浅、数量明显减少，可见不同程度神经元损伤。而给予QFY和二甲双胍后，神经元形态较好，胞内尼氏小体的数目比模型组明显增多，说明QFY干预可以有效减轻2型DCI大鼠神经元损伤，起到保护神经元的作用，见Fig 1。

Fig 1 Effect of QFY on Nissl bodies of hippocampus CA1 in type 2 DCI rats (×400) QFYL and QFYH represented QFY low and high dose group.

2.4 QFY对2型DCI大鼠海马小胶质细胞的影响Iba-1是小胶质细胞的标志物，模型组海马DG区小胶质细胞明显增多(P<0.01)，而给予QFY不同剂量(P<0.01)和二甲双胍(P<0.05)后均能有效降低小胶质细胞的数目，保护海马免受炎症损伤,见Fig 2,3。

Fig 2 Effect of QFY on expression of Iba-1 in hippocampus DG in type 2 DCI rats (×15)A: Control，B: Model，C: Metformin，D: QFYD，E: QFYH

Fig 3 Immunofluorescence results of Iba-1 in hippocampus DG n=4)##P<0.01 vs control；*P<0.05，**P<0.01 vs model.

2.5 QFY对2型DCI大鼠TNF-α、IL-6、IL-10和BDNF含量的影响与空白组相比，模型组血清中TNF-α(P<0.01)、IL-6(P<0.01)含量明显升高，IL-10(P<0.01)和海马组织中BDNF(P<0.01)明显下降，说明2型DCI会引起大鼠体内炎症因子TNF-α和IL-6表达升高、抑炎因子IL-10和BDNF表达下降；给予QFY后，大鼠血清中TNF-α(P<0.05)和IL-6(P<0.05)的水平明显下降，抑炎因子IL-10(P<0.01)明显升高，BDNF的水平也明显上升(P<0.01),见Tab 3。

Tab 3 Effect of QFY on contents of TNF-α, IL-6, IL-10 and BDNF in type 2 DCI rats , n=6)

Tab 4 Effect of QFY on expression of JAK2/STAT3 pathway in type 2 DCI n=6)

2.6 QFY对2型DCI大鼠JAK2/STAT3通路表达的影响与空白组相比，模型组的p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的比值均明显升高，而QFY不同剂量组和二甲双胍组则能明显降低JAK2和STAT3的磷酸化水平,见Fig 4。

Fig 4 Effect of QFY on expression of JAK2/STAT3 pathway in type 2 DCI rats A:Control，B: Model，C: Metformin，D: QFYD，E: QFYH)

3 讨论

根据目前报道降糖药二甲双胍、格列本脲和罗格列酮等[12]虽然能减轻糖尿病认知损伤，但尚无有效针对治疗2型DCI的药物上市，仍需对其机制进行深入研究。采用中医药治疗2型DCI具有一定优势，糖尿病久之则心脾两虚，痰瘀互结，蒙蔽清窍，出现健忘痴呆，而QFY可扶正祛邪，杜绝痰瘀之内生，又荣养脑神，改善病理损伤，这与本实验研究结果一致，QFY能有效提升2型DCI大鼠水迷宫成绩，提高其学习记忆能力，减轻神经元损伤。相比模型组大鼠，QFY(8.6 g·kg-1)能明显降低空腹血糖。注射STZ后，模型组血糖水平在4周内持续升高，但QFY(8.6 g·kg-1)可以抑制血糖上升，使血糖水平保持稳定，这可能使神经病变的概率减小[3]。

近年来，2型糖尿病的“炎症学说”被广泛关注，部分学者认为其是一种慢性免疫性疾病，实验研究发现小鼠饲喂高脂饲料并注射STZ后使其血糖升高能明显增加其外周和海马炎症的发生，促进增加小胶质细胞和星形胶质细胞[13]。小胶质细胞活化后，能激活NADPH酶，释放超氧阴离子以及促炎因子IFN、TNF-α、IL-6、IL-1β等损伤神经元，除此之外，小胶质细胞还可以通过分泌BDNF、吞噬突触等功能影响大脑发育和可塑性。本实验研究发现，QFY不同剂量组能明显降低血清促炎因子TNF-α、IL-6水平，增加抑炎因子IL-10水平和海马BDNF的含量，有效降低海马部位Iba-1阳性表达，抑制小胶质细胞活化。

JAK2/STAT3作为调控小胶质细胞活化的通路之一，可响应炎症因子如IL-6，被炎症激活。研究发现抑制JAK2/STAT3通路磷酸化能有效改善大鼠脑缺血再灌注损伤[14-15]。本研究结果显示，QFY不同剂量组能明显抑制JAK2、STAT3的磷酸化水平，从而抑制炎症。

综上，本文研究结果显示，QFY具有改善2型DCI大鼠认知功能、降低空腹血糖值、减轻神经炎症等作用，其机制与调控JAK2/STAT3信号通路及抑制小胶质细胞活化、保护神经元等有关，为深入探究QFY的化痰祛瘀、扶正祛邪及脑保护作用提供了重要参考。