陈 滢，周 南，王 杰，倪倩倩，赵 倩

(1. 安徽医科大学护理学院；2.安徽医科大学基础医学院；3. 中国科学技术大学附属第一医院产科； 4. 安徽医科大学第一附属医院新生儿科，安徽 合肥 230032)

内质网(endoplasmic reticulum, ER)是蛋白质折叠、翻译后修饰以及分泌性蛋白和膜蛋白转运的场所。环境和/或宿主的诸多因素可以造成ER应激，继而触发未折叠蛋白反应(unfolded protein reponse, UPR)[1]。此时细胞会产生一系列的保护反应，通过抑制蛋白的翻译、降解错误折叠蛋白以及促进错误蛋白的重新折叠，从而恢复ER的稳态。但如果错误折叠蛋白超出了ER的清除能力，便会诱发持续的ER应激，导致细胞凋亡，甚至细胞死亡[2]。

肠黏膜屏障是机体抵挡外来侵袭的一道重要防线。由于各种急慢性刺激，如病原菌入侵、缺血再灌注、膳食代谢物和毒素的影响等，均可导致肠上皮屏障的损伤，造成肠源性感染诱发肠道炎症，继而引起肠上皮细胞凋亡或坏死，甚至发展为全身炎症反应综合征，直至患者死亡[2]。研究表明，多种细胞因子及其介导的信号传导途径参与肠道炎症的发生和发展。其中，杯状细胞、潘氏细胞等具有强大分泌功能的肠上皮细胞，其蛋白质合成和加工的负荷较重，对ER应激尤为敏感。近年来的研究表明，ER应激参与肠上皮屏障功能的调节，是肠道炎症发生的重要发病机制之一[5-6]。

中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)是一个高度保守的可溶性蛋白，分子量约为18 ku。运用微阵列技术筛选与ER应激相关的基因发现，MANF是对ER应激最为敏感的基因[7]。之后，多项研究均证明MANF在ER应激相关疾病中具有明确的保护作用[8-12]。脑缺血可触发ER应激并增强MANF的表达，重组人MANF可促进神经元的增殖，防止神经元凋亡[8-9]。ER应激相关蛋白在胰腺细胞特异性MANF缺陷小鼠中表达上调，重组MANF能促进胰腺β细胞的增殖，可能成为糖尿病再生治疗的潜在靶点[10]。此外，我们前期的研究还表明，炎症可以触发ER应激，促进MANF定位于细胞核，干扰p65与其靶基因启动子结合，抑制NF-κB通路激活，从而抑制炎性滑膜细胞增殖[11]。MANF还可以通过抑制NF-κB/Snail信号通路，在肝脏ER应激与炎症的关系中发挥重要作用，可能是肝癌的潜在治疗靶点[12]。

但是MANF在肠道炎症中的作用尚无报道。由于MANF与ER应激密切相关，且ER应激是肠道炎症发生发展的重要分子机制之一。本实验拟在正常人小肠上皮细胞系FHs 74 Int中过表达MANF，并用ER应激诱导剂TM或TNF-α刺激，探究MANF对ER应激诱导的肠道上皮细胞损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株及质粒 细胞系FHs 74 Int购自北纳生物公司；pEGFP-C2-MANF质粒为安徽医科大学沈玉先教授课题组惠赠；pEGFP-C2载体质粒为本课题组保存。

1.1.2试剂 转染试剂Lipofectamine 2000、ECL发光液(美国Thermo Fisher Scientific公司)；DMEM培养基(美国HyClone公司)；Tunicamycin(上海生工)；TNF-α(美国MCE公司)；MANF、cleaved caspase-3、CHOP、Bip、β-actin抗体(英国Abcam公司)；Bcl-2、Bax抗体(中国proteintech公司)；CCK8试剂盒(上海碧云天)；PE Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒 (美国BD公司)。

1.1.3仪器 超净工作台(江苏苏静集团)；电泳仪、凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)；CytoFLEX分析流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)

1.2 方法

1.2.1MANF过表达正常人小肠上皮细胞FHs 74 Int细胞 参照Lipofectamine 2000说明书将MANF-GFP质粒转染FHs 74 Int细胞，同步转染空载体GFP为对照。转染24 h后荧光显微镜观察各组转染效率。

1.2.2免疫印迹法(Western blot) 用裂解液裂解细胞，提取总蛋白，金属浴煮沸样品10 min，上样15 μL至SDS-PAGE胶电泳，槽式湿转法转移蛋白至NC膜，封闭缓冲液封闭1 h后分别用MANF、Bip、CHOP、cleaved-caspase-3、β-actin等抗体于4 ℃冰箱过夜，二抗在室温条件下孵育1 h后蛋白显影。

1.2.3CCK8检测细胞增殖 将FHs 74 Int细胞按相应组别接种于96孔培养板中，按说明书加入CCK8溶液，孵育1 h，上机测定OD值。

1.2.4流式细胞术(flow cytometry)检测细胞凋亡 分别收集相应组别的FHs 74 Int细胞。以1 000 r·min-1转速收集细胞沉淀，PBS清洗2遍。将10×Binding buffer用双蒸水稀释成1×Binding buffer，用1×Binding buffer将FHs 74 Int细胞重悬为1×109L-1细胞悬液。吸取100 μL加入流式管中，按照说明书添加5 μL的PE Annexin Ⅴ和7-AAD至各组样品管，用移液器充分混匀后，室温避光孵育15 min，上机前补加400 μL 1×Binding buffer用于检测。

2 结果

2.1 ER应激可诱导小肠上皮细胞内MANF表达增多在正常人小上皮细胞FHs 74 Int细胞培养基中给予ER应激诱导剂TM (2 mg·L-1) 或TNF-α (0.785 μg·L-1)刺激后，MANF分别从加药后3 h(Fig 1)和9 h(Fig 2)开始表达增多，并呈时间依赖关系。提示肠上皮细胞内发生ER应激的早期即可以诱导MANF的表达。

Fig 1 TM induced MANF expression in intestinal A: MANF protein levels at indicated time points were assessed by Western blot; B: The gray value was detected for A, *P<0.05, **P<0.01 vs 0 h.

Fig 2 TNF-α induced MANF expression in intestinal A: MANF protein levels at indicated time points were assessed by Western blot; B: The gray value was detected for A, **P<0.01 vs 0 h.

2.2 MANF抑制小肠上皮细胞内的ER应激分别将MANF-GFP与空载体GFP质粒转染FHs 74 Int细胞，观察到绿色荧光，提示外源性MANF在小肠上皮细胞中成功表达(Fig 3)。转染后16 h，用TM刺激细胞24 h后观察ER应激指标。结果显示，过表达MANF可以减少TM刺激后的ER应激相关蛋白Bip、CHOP的表达(Fig 4)，提示MANF具有抑制ER应激的作用。

Fig 3 Successful expression of exogenous MANF in intestinal epithelial cells Cell status was observed under a microscope (Left panel), and the expression of green fluorescent protein was observed under a fluorescence microscope (right panel) (magnification 200×).

Fig 4 MANF protected intestinal epithelial cells A: ER stress related proteins were detected via Western blot; B: The gray value was detected for A, **P<0.01 vs GFP+TM.

2.3 MANF促进肠上皮细胞增殖用TM诱导肠上皮细胞发生ER应激后，CCK8细胞增殖实验发现细胞增殖能力减弱，并呈现剂量依赖性关系(Fig 5)。过表达MANF后可明显提高小肠上皮细胞的增殖活性(Fig 6)。结果表明肠上皮细胞中过表达MANF可以促进细胞增殖。

Fig 5 ER stress had effects on proliferation of The CCK8 assay showed that TM inhibited cell viability in a dose-dependent manner. **P<0.01 vs control.

Fig 6 MANF promoted proliferation of intestinal epithelial cells1：GFP+DMSO； 2：MANF-GFP+DMSO； 3：GFP+TM； 4：MANF-GFP+TM. The influence of MANF on intestinal epithelial cell proliferation was detected by CCK8 assay. **P<0.01 vs GFP+DMSO； ##P<0.01 vs GFP+TM.

2.4 MANF抑制ER应激诱导的小肠上皮细胞的凋亡Western blot结果显示，转染MANF-GFP质粒可以显著降低TM诱导后FHs 74 Int细胞中促凋亡蛋白cleaved-caspase-3和Bax的生成，提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(Fig 7)；flow cytometry显示，TM刺激后，GFP组发生凋亡的细胞比例(27.9±0.535 4)，高于MANF-GFP组发生凋亡的细胞比例(17.93±0.495 7)(Fig 8)。结果表明过表达MANF可以抑制ER应激诱导的小肠上皮细胞的凋亡。

Fig 7 MANF inhibited TM-induced ER stress-mediated A: The expression of apoptosis-related proteins was detected by Western blot; B: The gray value was detected for A. **P<0.01 vs GFP+TM.

Fig 8 MANF inhibited TM-induced ER stress-mediated A: Representative flow cytometry density plots of apoptosis rates of intestinal epithelial cells; B: Statistical bar chart of A. 1：GFP+DMSO； 2：MANF-GFP+DMSO； 3：GFP+TM； 4：MANF-GFP+TM. **P<0.01 vs GFP+DMSO;##P<0.01 vs GFP+TM.

3 讨论

功能失调的ER应激和UPR是肠道炎症的发病原因之一。因此，以减轻ER应激为靶点的药物可能是治疗肠炎的有效选择[13]。本研究表明，MANF可以明显抑制小肠上皮细胞内的ER应激，促进肠上皮细胞的增殖能力并减少其凋亡。

MANF是一种对ER应激敏感的可溶性分泌蛋白[7]。在脑缺血的早期即可上调表达，甚至早于ER应激的标志性蛋白CHOP[8]。本研究发现，诱导FHs 74 Int细胞发生ER应激后，内源性的MANF分别从TM处理后3 h和TNF-α处理后9 h开始表达增多，再次证明ER应激早期即可以诱导MANF的表达。

有研究表明[14-15]，MANF的表达上调是对ER应激的适应性反应，MANF的表达有助于缓解UPR。UPR信号转导作用主要依赖PERK、IRE1和ATF6 3种ER跨膜蛋白。在稳态情况下，Bip结合并封闭上述3个信号分子，使其保持于非激活的状态，并稳定在ER膜上。但Bip和非折叠蛋白有更强的亲和力，当ER中滞留非折叠蛋白时，Bip则会同其结合，并释放PERK、IRE1和ATF6，继而激活UPR的3条信号通路。PERK和ATF6均可诱导CHOP的表达，故一般认为Bip和CHOP均为ER应激的标志蛋白[1, 16]。本研究发现，给予ER应激诱导剂后，Bip和CHOP的表达增多。相较转染空载体的对照组，MANF可以明显抑制ER应激相关蛋白Bip和CHOP的表达，表明MANF发挥抑制ER应激的作用。

当ER应激持续加重，则会通过激活caspase-12和CHOP途径诱导细胞的凋亡。ER应激可以激活caspase-12，继而切割caspase-9，使caspase-3激活，导致细胞凋亡[17]。在肠炎模型中，与全身缺失CHOP的小鼠相比，野生型小鼠肠黏膜中有大量凋亡细胞，提示CHOP基因表达上调加重了细胞凋亡和结肠炎的发生[18]。在本研究中，我们用Bcl-2, Bax和cleaved-caspase-3以及Annexin Ⅴ和7-AAD凋亡流式检测来表征细胞凋亡的水平，发现MANF可以抑制ER应激诱导的细胞凋亡。同时我们还观察到ER应激抑制肠上皮细胞增殖，并呈现剂量依赖的关系，提示ER应激越严重，对上皮细胞的增殖抑制作用越明显，但过表达MANF可明显缓解此现象。

以上结果提示，MANF在肠上皮细胞发生ER应激的早期即可明显上调，并具有抑制ER应激，促进肠上皮细胞增殖，抑制其凋亡的保护作用。从而发挥肠黏膜屏障保护和抑制肠道炎症的潜在治疗作用。然而MANF影响ER应激发生的具体分子机制尚待阐明。本研究为MANF促进肠上皮细胞功能修复提供一定的理论依据。