李 军，田秋梅，闫 蓉，郭 敏，吴方雄

（1. 陕西省森林工业职工医院肿瘤二科，陕西西安 710300；2. 西安医学院第一附属医院消化内科，陕西西安 710077）

结肠癌（colorectal cancer, CRC）是在结肠部位发生率很高的一种消化道恶性肿瘤，特别是在直肠与乙状结肠相交的部位，40～50 岁之间结肠癌的发病率较高[1]。在胃肠道肿瘤发病率中结肠癌排第3 位[2]。目前，传统手术仍然是结肠癌的主要治疗方法，化学疗法等作为辅助治疗方法。然而，由于治疗时间延长、耐药等其他不良反应的发生，治疗效果不佳[3]。因此，发掘传统中药资源，研究其对结肠癌的作用效果及其作用机制具有重要的科学和临床意义。

细胞凋亡与肿瘤的发生息息相关。细胞凋亡是一个多种基因参与调控、高度有序、细胞内一系列酶级联主动参与的分子调控的过程[4]。凋亡的失调可能会导致多种疾病的发生，凋亡不足可以引起如肿瘤及自身免疫病的发生，在肿瘤细胞中50%在凋亡机制上存在缺陷[5]。Bcl-2 家族分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。促凋亡蛋白质主要包括Bax、Bcl-Xl、Bak 和Bad 等，抗凋亡蛋白质则主要包括 Bcl-2、Bcl-XL 和Mcl-1 等。促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白之间可以相互作用，构成一个相互制约的、相互作用的复杂精细的细胞凋亡调控网络[6]。

大多数的肿瘤细胞周期与其对应的正常细胞周期相同，个别的甚至更长，因此肿瘤是一种细胞周期的疾病[7]。通常在细胞生长过程中，G1期是细胞生长的时期，这一时期细胞物质代谢十分活跃，细胞体积较大，进行RNA 与蛋白质的合成[8]。目前已经发现的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）有20 多种亚型，包括 CDK1、CDK2、CDK4、CDK6 等；细胞周期蛋 白（cyclin）有 A、B、C、D、E、F 等 多 种 亚 型[9]。CDK、cyclin 以及二者复合物，与细胞的增殖和分化均有着密切的联系[10]。

呋喃香豆素类化合物在许多天然产物中含量丰富，如白芷、当归等。研究发现，其具有各种药理活性，如抗炎镇痛、抗凝血、抗心律失常、抗肿瘤作用等[11]。BFD-6b（图1）是一种新型的联苯呋喃香豆素类化合物，其联苯结构的设计使得化合物具有血管舒张作用，叔胺侧链的引入提高水溶性，优化其理化性质[12]。本研究中，采用体外细胞培养、药物干预、MTT、流式细胞术、免疫印迹等方法，考察BFD-6b对结肠癌细胞增殖的影响及其作用机制。

图1 BFD-6b 分子结构式Fig.1 The chemical structural formula of BFD-6b

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

胎牛血清购自美国Amresco 公司，噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma-Aldrich 公司，二甲基亚砜（DMSO）购自天津市科密欧化学试剂有限公司，注射用青、链霉素购自陕西先锋生物有限公司，UItraSingna 超敏ECL 化学发光底物购自正四柏生物有限公司，脱脂奶粉购自伊利，PI 双染法细胞凋亡检测试剂盒及免疫印迹实验所用抗体均购自美国Proteintech，1640 培养基购自上海培源生物科技股份有限公司，胰酶购自Solarbio，PBS 购自上海培源生物科技股份有限公司，Tween20购自PIONEER。

1.2 细胞株

细胞株（SW480、MCF-7、HELA、H1299、H460、MHCC-97H、A549、MS751、BEL-7402、SMMC-7721、SK-HEP-1、T47D、SW620、Lovo、HCT116）购自中国科学院上海细胞研究所。细胞在37 ℃、50 mL/L CO2饱和湿度条件下的孵育箱中进行培养。

1.3 方法

1.3.1 细胞增殖实验 取不同的细胞株，比较BFD-6b 对不同种类细胞增殖的影响。将细胞接种于 96 孔板（180 μL/孔），放置 37 ℃、50 mL/L CO2饱和湿度的孵育箱中培养24 h。次日加入用无血清无双抗的培养基配制的8 个浓度梯度（0.39 μmol/L、0.78 μmol/L、1.56 μmol/L、3.12 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L）的 待 测 药 品BFD-6b，每个浓度设置10 个复孔。阴性对照：等量培养基未加药；空白对照：等量无细胞且无血清无双抗的培养基。加完药后放于37 ℃、50 mL/L CO2饱和湿度的孵育箱内培养。48 h 后取出孔板，在超净工作台中进行操作，小心吸出每个孔中的培养基，加入配制好的 MTT 溶液（200 μL/孔）。在 37 ℃，50 mL/L CO2饱和湿度孵育箱中继续培养，4 h 后将96 孔板中培养基吸干净，每孔加入DMSO 150 μL，在摇床上使其混合均匀（15 min）。使用超微量分光光度计在490 nm 波长处测定吸光度（A）值。

1.3.2 细胞周期实验 待细胞生长至对数期时，接种细胞于细胞培养皿中，分别标注阴性、小浓度（1.56 μmol/L）、中浓度（3.12 μmol/L）、高浓度（6.25 μmol/L），放置37 ℃孵育箱中培养48 h，次日加药。将细胞消化后收集到10 mL EP 管中，离心（5 min，1 000 r/min），弃去培养液，加预冷的 PBS 清洗，离心（5 min，1 000 r/min）。每个EP 管中加入1 mL 预冷的700 mL/L 乙醇，在-20 ℃中放置 2 h，离心（5 min，1 000 r/min），小心吸去乙醇后，每管加入1 mL PBS，离心（5 min，1 000 r/min），弃上清液。室温条件下每管加 1 mL RNA 酶（避光操作），反应 30 min 后离心（5 min，1 000 r/min），吸出上清液。每管加入PBS（500 μL），以及PI（25 μL）染色，使用流式细胞分析仪检测（避光操作）。

1.3.3 细胞凋亡实验 待细胞生长至对数期时，接种细胞于细胞培养皿中，分别标注阴性、小浓度（1.56 μmol/L）、中浓度（3.12 μmol/L）、高浓度（6.25 μmol/L），放置37 ℃孵育箱中培养48 h，次日加药。将细胞消化后收集到10 mL EP 管中，离心（5 min，1 000 r/min），弃去培养液，加预冷的PBS 清洗，离心（5 min，1 000 r/min）。按照凋亡试剂盒说明书进行操作，对细胞进行PI 和Annexin V-FITC 双染色。在4 ℃下避光孵育20 min 后用流式细胞分析仪检测。

1.3.4 蛋白免疫印迹分析 待细胞生长至对数期时，接种细胞于细胞培养皿中，分别标注阴性、小浓度（1.56 μmol/L）、中浓度（3.12 μmol/L）、高浓度（6.25 μmol/L），放置37 ℃孵育箱中培养48 h，次日加药。用PBS 清洗细胞，加入细胞裂解液（10%蛋白酶抑制剂∶10%磷酸酶抑制剂∶80% RIPA=8∶1∶1 体积比），在4 ℃条件下裂解30 min。用刮刀将培养皿底的细胞刮干净，移至1.5 mL EP管中。使用细胞超声破碎仪破碎细胞，共6次，每次3 s（冰上)，完成后，冷冻离心机离心（12 000 r/min，10 min，4 ℃），吸取上清液。加入适量5×loading buffer（上清液∶5×loading buffer=4∶1），加热煮沸5 min 使蛋白变性。将蛋白样品上样分析，转移至PVDF 膜上，使用脱脂奶粉封闭1 h，孵育一抗后，4 ℃条件下过夜。然后孵育二抗（37 ℃，30 min），之后进行显影。

1.3.5 统计学分析 统计分析由SPSS 软件（14.0，芝加哥，美国）来计算。数据以平均值±标准误（）来表示，用 One-way ANOVA 进行统计分析，计算相应的统计学参数。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 BFD-6b 对不同癌症细胞增殖的抑制作用

由 图 2 可 知 ，BFD-6b 对 SW480、MCF-7、HELA、H1299、H460、A549 等肿瘤细胞的增殖均有抑制作用，而对 A549、MS751、BEL-7402、SMMC-7721、SK-HEP-1、T47D 细 胞 增 殖 影 响 不 明 显 。BFD-6b 对SW480 作用最强，效果最明显，所以选取SW480 作为初步研究的细胞株。BFD-6b 对SW480细胞增殖具有较好的抑制作用，且呈浓度依赖性，其IC50值为 7.09 μmol/L。

图2 BFD-6b 对肿瘤细胞增殖的影响Fig.2 The effect of BFD-6b on cell proliferation (n=3)

由上可知，BFD-6b 对结肠癌细胞增殖具有较强的抑制作用，因此本研究又选取了几种结肠癌细胞，考察BFD-6b 对结肠癌的增殖抑制作用。由图3A 可知，BFD-6b 对 SW620、Lovo、HCT116 细胞增殖均有较强的抑制作用，且呈浓度依赖性，其IC50值分别为7.23、8.08、8.96 μmol/L。由此可见，BFD-6b 对结肠癌细胞均具有明显的抗肿瘤作用，因SW480 细胞对其最为敏感，因此后续实验中选择SW480 作为研究对象。图3B 结果表明，BFD-6b 对SW480 细胞增殖不仅具有量效关系，同时具有时间依赖关系，其作用SW480 细胞 24、48、72 h 的 IC50值分别为＞50、7.09、5.86 μmol/L。

图3 BFD-6b 对结肠癌细胞增殖的影响Fig.3 The effect of BFD-6b on cell proliferation (n=3)

2.2 BFD-6b 对结肠癌细胞SW480 凋亡的影响

为了进一步了解BFD-6b 对SW480 增殖的影响，对细胞进行Annexin V-FITC/PI 双染，用流式细胞仪检测BFD-6b 对细胞凋亡的诱导作用。由图4 可知，BFD-6b对SW480细胞具有明显诱导凋亡的作用，并且随着药物浓度的递增，细胞凋亡率增多。当BFD-6b的作用浓度分别为 0、1.56、3.12、6.25 μmol/L 时，SW480细胞的凋亡率为4.94%、9.42%、11.35%及27.81%。

图4 BFD-6b 对SW480 细胞凋亡的影响Fig.4 The effect of BFD-6b on SW480 cell apoptosis (n=3)

2.3 BFD-6b 对凋亡相关蛋白表达的影响

采用Western blotting 的方法考察BFD-6b 作用于SW480 细胞后对凋亡相关蛋白表达的影响。结果显示，BFD-6b 作用于SW480 细胞后，明显下调抑凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2 的表达，上调促凋亡蛋白BAK、BAX 表达（图 5）。

图5 BFD-6b 对SW480 细胞凋亡相关蛋白表达的影响Fig.5 The effect of BFD-6b on the expressions of cell apoptotic-related proteins (n=3)

2.4 BFD-6b 对结肠癌细胞SW480 周期的影响

为了探究BFD-6b 抑制SW480 增殖的作用机制，利用流式细胞仪进一步检测BFD-6b 对细胞周期变化的影响。由图6 可知，BFD-6b 对SW480 周期变化有明显影响，随着药物浓度增大，G1期细胞逐渐增多，分别为50.39%（阴性）、52.41%（1.56 μmol/L）、55.73%（3.12 μmol/L）、67.16%（6.25 μmol/L）。表明BFD-6b可阻滞细胞于G1期，从而延长细胞周期，抑制细胞增殖。

图6 BFD-6b 对SW480 细胞周期的影响Fig.6 The effect of BFD-6b on SW480 cell cycle (n=3)

2.5 BFD-6b 对周期相关蛋白表达的影响

采用Western blotting 的方法考察BFD-6b 作用于SW480 细胞后对周期相关蛋白表达的影响。结果显示；BFD-6b 作用于SW480 细胞后，明显下调细胞周期蛋白cyclinE、cyclinD1 以及细胞周期蛋白依赖性激酶CDC2 的表达（图7）。

图7 BFD-6b 对SW480 细胞周期相关蛋白表达的影响Fig.7 The effect of BFD-6b on the expressions of cell cycle-related proteins (n=3)

3 讨 论

结肠癌是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，随着人们生活水平的提高，发病率逐年增加[13]。前期报道欧前胡素具有抗肿瘤作用，为了进一步研究，本团队对其结构进行了优化，得到了其衍生物BFD-6b，进而进行BFD-6b 抗结肠癌作用初步研究。本研究中采用MTT 法进行初筛后，结果显示 BFD-6b 对 SW480 细胞增殖抑制效果最强，且呈浓度依赖性。同时，BFD-6b 对 SW620、Lovo、HCT116 结肠癌细胞增殖均有较强的抑制作用，且呈浓度依赖性。因SW480 细胞对其最为敏感，因此后续实验中选择SW480作为研究对象。

凋亡过程的紊乱可能与肿瘤的发生有直接或间接的关系，由于肿瘤细胞无法对其生长进行正常调控，导致异常增殖[14]。本研究结果显示，BFD-6b 可有效诱导SW480 细胞凋亡，且随给药浓度增加，细胞凋亡的比例依次上升。Bcl-2 蛋白家族是细胞凋亡相关内源性线粒体通路的关键蛋白，主要包括促凋亡蛋白 BAX、BAK 等和抗凋亡蛋白 Bcl-2 和 Mcl-1 等。本研究免疫印迹结果表明，BFD-6b 可下调抑凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2 的表达量，上调促凋亡蛋白BAK、BAX 表达量从而诱导细胞凋亡。

细胞周期是一次细胞分裂完成到下一次细胞分裂结束的整个过程，包括G1期、S 期、G2期。调控参与细胞周期的相关蛋白，能够使肿瘤细胞的活性得到抑制，并进一步阻滞肿瘤细胞的无限增殖，达到治疗肿瘤的目的[15]。本研究结果显示，BFD-6b 对SW480 周期变化有明显影响，随着药物浓度增大，G1期细胞逐渐增多，表明BFD-6b可阻滞细胞于G1期，从而延长细胞周期，抑制细胞增殖。cyclinD1 为G1期进展的限速调节因子，cyclinD1 表达水平下降，可阻滞细胞于G1期；cyclinE 是细胞周期从G1期转向S 期的重要蛋白，其表达量减少可阻滞细胞由G1期进入S 期；CDC 可以与 cyclinA 和 cyclinB 结合控制 S 期到 G2期和 G2期到M 期两个控制点，因此CDC 表达减少，抑制细胞从S 期到G2期和G2期到M 期。本研究蛋白免疫印迹结果表明，BFD-6b 可下调细胞周期蛋白cyclinD1、cyclinE 以及细胞周期蛋白依赖性激酶CDC2 的表达量，从而将细胞周期阻滞于G1期，抑制细胞增殖。

综上，BFD-6b 作用于SW480 细胞通过下调细胞周期蛋白cyclinD1、cyclinE 以及细胞周期蛋白依赖性激酶CDC2 蛋白表达，阻滞SW480 细胞于G1期；同时通过下调抑凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2 蛋白表达，上调促凋亡蛋白BAK、BAX 蛋白表达诱导细胞凋亡，从而抑制结肠癌细胞SW480 的增殖。