李 姚，孔祥聪，琚兴波，侯强川，郭 壮，王玉荣,

（1.湖北文理学院，湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北襄阳 441053；2.湖北文理学院，乳酸菌生物技术与工程襄阳市重点实验室，湖北襄阳 441053；3.湖北璩家餐饮管理有限公司，湖北襄阳 441000）

浆水是以芹菜或白菜等为主料加少量面粉和大量水自然发酵而成的，其不仅是中国地理标识产品酸浆面的特征风味来源，亦是陕南和甘肃等地浆水面的主要配料[1]。近年来研究人员针对酸浆水及其微生物开展了多项研究，主要包括微生物多样性[2]、降胆固醇菌株的筛选[3]、亚硝酸盐含量分析[4]以及相关饮料研制[5]等方面，而有关酸浆水发酵方式上的研究相对较少。目前，酸浆水的制作以农家自制为主，一般采用自然发酵的方式，发酵进程较难调控，产品品质不稳定，发展受限。张晓辉等[6]对采集自山西和甘肃的浆水中细菌多样性进行分析发现，浆水中存在致腐菌和条件致病菌，说明急需改善加工环境或筛选适于酸浆水发酵的菌株来降低潜在风险。王丽萍等[7]探讨了面粉添加量、发酵温度和保藏方法等工艺因素对浆水品质的影响，阐明实现浆水品质的标准化的重要途径为选择特定菌种发酵。亦有研究人员发现，纯种发酵更适合发酵蔬菜类制品的制作[8]。周书楠等[9]研究发现，乳酸杆菌是琚湾酸浆面浆水中的绝对优势细菌微生物，并推测乳酸菌发酵对于酸浆水风味的形成起着至关重要的作用。采用16S rRNA 高通量测序技术，彭飞等[10]发现乳酸杆菌属亦是北方浆水中的优势菌属。张振东等[11]采用六种纯培养方式对酸浆水中乳酸菌进行分离，发酵乳杆菌的株数占总分离株的48.89%，变性梯度凝胶电泳结果亦显示发酵乳杆菌和德式乳杆菌为酸浆水中的主要乳酸菌。这些研究为筛选酸浆水发酵菌株提供了指导。

本研究分别采用发酵乳杆菌纯种发酵和加引子发酵两种方式制作浆水，并尝试使用电子舌、电子鼻和色度仪从滋味、风味和色泽三个维度对浆水的感官品质进行评价。电子舌通过人工脂膜技术可实现同时对浆水中基本味（酸、苦、涩、咸和鲜味）以及回味（涩、苦和鲜味）进行测定，具有检测速度快、结果准确等优点，目前，在葡萄酒[12]、蜂蜜[13]、蘑菇[14]和奶制品[15]等食品的滋味检测中应用广泛。电子鼻通过其金属氧化电极对食品中典型挥发性风味物质进行测定，从而对浆水挥发性风味进行评价，常用于水果[16]、猪肉[17]、白酒[18]和食用油[19]等食品的检测。色度仪则直接显示三刺激值并将其转化为颜色空间标度，从而对食品的明亮度、红蓝度和黄绿度进行测定，目前广泛应用于饮用水[20]、番茄酱[21]、牛肉鲜度[22]和鲜切果蔬褐变程度[23]等的检测。通过比较乳酸菌纯种发酵和加引子发酵浆水品质差异，以期为酸浆水的纯种发酵以及即食型产品的生产提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸浆水 采集自襄阳市枣阳市琚湾镇各大面馆，主要原料均为芹菜和面粉，经24 h 左右自然发酵而成；纯种发酵用菌株 由传统发酵食品研究所提供，即对15 个酸浆水样本中乳酸菌进行分离鉴定，然后从每个样本中挑选一株发酵乳杆菌进行后续实验，共计15 株；芹菜 市售；面粉 中粮面业（海宁）有限公司；葡萄糖 西陇科学股份有限公司；氯化钠国药集团化学试剂有限公司；MRS 培养基 青岛海博生物技术有限公司；阳离子溶液、阴离子溶液、内部溶液、预处理溶液、参比溶液 日本Insent 公司。

SA 402B 电子舌（配备5 个味觉传感器电极和2 个参比电极） 日本Insent 公司；PEN3 电子鼻（配备10 个金属氧化电极） 德国Airsense 公司；Ultra Scan PRO 色度仪 美国Hunter Lab 公司；CR21N 高速离心机 日本日立公司；PHS-3C 台式酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；LRH-70 生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集 从湖北省襄阳市枣阳市琚湾镇的不同面馆采集15 份自然发酵酸浆面浆水样品，装入无菌采样瓶后密封置于含有冰盒的采样箱中低温运回实验室迅速完成乳酸菌的分离纯化。

1.2.2 酸浆水样品制作 原料前处理：取纯净水煮沸后按0.5%（w/v）比例添加面粉制备面粉浆液，煮沸放凉按1%比例加入漂烫过的芹菜，搅拌均匀制成浆汤后分装至小发酵罐中，每罐500 mL 备用。

浆水制备：将前期分离至酸浆面浆水的15 株发酵乳杆菌接入MRS 培养基中活化（37 ℃静置培养24 h）两代后10000 r/min 离心10 min，沉淀即为菌体，取菌体接入含1%葡萄糖的100 mL 面粉浆液中30 ℃静置培养24 h 制成菌液。将菌液按5%（v/v）的比例接入分装好的浆汤中，30 ℃发酵24 h，制备纯种发酵浆水，编号分别为T1～T15。以采集的15 份自然发酵酸浆为引子，按照5%（v/v）的比例加入到制备好的浆汤，30 ℃发酵24 h，制备引子发酵酸浆，编号依次为Z1～Z15。制备T1 的发酵乳杆菌分离至制备Z1 的引子，制备T2 的菌株来源于发酵Z2 的引子，依次类推。

1.2.3 不同发酵方式浆水滋味特征分析 准确量取50 mL 发酵后的浆水样品和100 mL 纯净水混合均匀，静置30 min 后进行抽滤，取滤液参考王丹丹等[24]的测试方法使用电子舌进行参数测试。为减少系统误差，每次测定时均设置Z1 号样品作为对照样本，数据分析时待测样品与对照样本的差值即为待测样品各滋味品质的相对强度值。

1.2.4 不同发酵方式浆水挥发性风味测定 准确吸取15 mL 发酵好的浆水于电子鼻样品瓶中，水浴锅中50 ℃保温30 min，室温平衡10 min 后插入电子鼻探头进行进样，参考张松等[25]的测试方法进行参数测试。每个样品测试90 s，由于传感器的响应值在70 s 后达到稳定，选取85、86 和87 s 时的响应值作为本研究的测试结果。

1.2.5 不同发酵方式浆水色泽分析 本研究参考郭壮等[26]的研究对不同发酵方式浆水的色泽进行评价。将浆水装入50 mm×50 mm 的专用比色皿中，采用色度仪对其色泽品质进行评价，测试模式选择透视测试，读数以CIE1976 色度空间值L*（暗→亮：0→100），a*（绿-→红+），b*（蓝-→黄+）表示。

1.3 数据处理

采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic，UPGMA）和多元方差分析法（multivariate analysis of vari-ance，MANOVA）对不同发酵方式浆水的整体品质进行分析，采用t检验、Mann-Whiney 检验和冗余分析（Redundancy analysis，RDA）对不同发酵方式浆水品质差异的关键性指标进行甄别。采用Cannoco 4.5 软件、MATLAB 2016b 软件和Origin 2017 完成数据分析和可视化。

2 结果与分析

2.1 不同发酵方式浆水品质分析

琚湾酸浆面风味特征为酸、香、辣，是湖北省非物质文化遗产和中国地理标识产品[27]，其酸味及主体香味主要来源于酸浆水，因此，酸浆水口感、风味等发酵特征对成品酸浆面品质有着重要的影响。本研究首先使用电子舌对15 份发酵乳杆菌单菌发酵酸浆水及15 份老卤水引子发酵酸浆水的滋味特征进行了测定，两类样本的8 个滋味指标测定结果见图1。

图1 不同发酵方式酸浆水各滋味指标相对强度箱型图Fig.1 Box diagram of relative intensity of each taste index of Suanjiangshui with different fermentation methods

由图1 可知，不同发酵方式制作的浆水酸、苦、涩、咸和鲜味之间均具有较大的差异，其中，涩味的差异性最大，酸味次之；后味A（涩的回味）、后味B（苦的回味）和丰度（鲜的回味）之间的差异性较小。发酵乳杆菌纯种发酵的浆水鲜味相对强度明显高于用引子发酵，而酸味和涩味正好相反。浆水经过多轮次发酵，其中的微生物相较冻存过的纯种菌株能更快适应浆汤环境，发酵产酸更快；此外，不同农户自制老卤水发酵轮次多且不尽相同也使得其中乳酸等有机酸不断积累，这也可能是导致用其发酵浆水酸度较单菌发酵浆水强度大且组内差异亦较后者明显的原因。值得注意的是不同发酵乳杆菌接菌发酵浆水涩味差异较大，表明这些菌株虽然都分离至自然发酵浆水但并不都适宜单独发酵酸浆水。

本研究进一步使用电子鼻对不同发酵方式浆水的挥发性风味进行了测定，结果见表1。

由表1 可知，发酵乳杆菌纯种发酵制作的浆水在三个对芳香类风味灵敏的传感器（W1C、W3C 和W5C）上的响应强度显著高于加引子发酵浆水（P＜0.05），而在对有机硫化物、萜类物质（W1W）以及烷烃灵敏的传感器（W3S）上的响应值呈现相反的趋势（P＜0.05）。由此可见，总体上发酵乳杆菌纯种发酵制备的浆水挥发性风味要明显优于用引子发酵的浆水，这与前期研究发现的发酵乳杆菌发酵的酸浆水芳香类风味物质的含量高于植物乳杆菌与德氏乳杆菌发酵浆水的结论相似[28]。此外，望诗琪等[29]采用气相色谱-质谱联用技术从琚湾酸浆面浆水中检测出的挥发性风味物质有159 种，并推测较高含量3-丁炔-1-丁醇的检出可能来源于浆水的盛装容器。因此，引子发酵浆水不良风味相对强度较单一菌株发酵浆水高可能是因为引子中微生物种类复杂，开放发酵易滋生污染菌。此外，部分引子原是盛于塑料容器中发酵，长时间循环使用亦可能掺入杂味。

表1 不同发酵方式酸浆水风味特性及差异Table 1 Flavor characteristics and differences of Suanjiangshui by different fermentation methods

为更准确显示接菌及加引子发酵酸浆水的色泽特征和差异，本研究使用色度仪对的色泽特征进行了测定，分析结果见表2。

表2 不同发酵方式酸浆水各色度指标的差异性分析Table 2 Analysis on the difference of chromaticity indexes of Suanjiangshui with different fermentation methods

好的浆水呈淡乳白色，略带绿色，色泽均匀不分层，表面无白膜。经检测，本研究采用引子发酵和接菌发酵制作的浆水色泽均较为明亮，整体偏绿偏蓝，符合酸浆水发酵特征。经对比，发酵乳杆菌纯种发酵制备的酸浆水其明亮度显著高于加引子发酵（P＜0.05），a*值则呈现出相反的趋势（P＜0.05）。由此可见，较之加引子发酵，乳酸菌纯种发酵的酸浆水颜色偏亮偏绿，通过计算发现二者色差值（△E*）为3.05，因而不同发酵方式对酸浆水色泽有明显的影响。不同发酵方式酸浆水色差明显可能与其酸度及发酵程度有关，电子舌检测结果显示，加引子发酵酸浆水酸度高于加发酵乳杆菌发酵，说明引子发酵酸浆水发酵程度更高，pH 降低及微生物活动会导致芹菜叶绿素损失率增加[30]。

2.2 不同发酵方式制备酸浆水整体品质差异性分析

本研究使用PCA、MANOVA 和UPGMA，以电子舌和电子鼻测试指标为对象，进一步探究了不同发酵方式酸浆水整体感官品质差异。由PCA 发现，总方差87.92%的贡献率来自于前6 个主成分（principal component，PC），其方差贡献率依次为32.89%、20.14%、13.65%、9.82%、6.40%和5.01%。由此可知，6 个主成分可以代表原始数据18 个变量的绝大部分信息。基于PC1 和PC2 不同发酵方式酸浆水品质的因子载荷图如图2 所示。

由图2 可知，影响接菌和引子发酵浆水整体品质的关键感官指标为涩味、酸味、W5S、W2W、W1W和W1C。涩味在PC1 中的系数为0.49，PC2 中载荷最高的正影响指标为酸味，其载荷量为0.40，而在PC2 中载荷最高的负影响指标为W1C（对芳香类物质灵敏），其载荷量为0.26。即PC1 的主要差异集中在涩味，而PC2 的主要差异则集中在酸味和W1C。基于PC1 和PC2 不同发酵方式酸浆水品质的因子得分图见图3。

图2 不同发酵方式酸浆水品质的因子载荷图Fig.2 Factor load diagram of Suanjiangshui quality with different fermentation methods

图3 不同发酵方式酸浆水品质的因子得分图Fig.3 Factor score diagram of Suanjiangshui quality with different fermentation methods

由图3 可知，基于感官特征接菌发酵与加引子发酵浆水样品具有明显的分离趋势，引子发酵酸浆水样本主要集中在X 轴正轴方向，发酵乳杆菌接菌发酵样品大多分布在第二、三象限，部分样品在横纵坐标上均较为分散。此外，引子发酵酸浆水Z12 与接菌发酵样本较为接近，而接菌发酵酸浆水T1、T7、T9 和T11 与引子发酵样品聚在一起，究其原因，引子来源于不同家庭手工制作酸浆水其微生物组成及品质不完全相同，因此15 个样本并未完全重叠，而15 株发酵乳杆菌来源于对应的15 个引子，引子和菌株发酵酸浆水部分样本品质会较为相近。引子发酵与接菌发酵对应编号样本间亦存在差异。结合因子载荷图，与接菌发酵浆水相比，引子发酵酸浆酸涩味较浓但芳香味却不及前者。整体上，乳酸菌纯种发酵的酸浆水在滋味和风味品质上要优于引子发酵。将数据进行归一化处理后，采用UPGMA 对PCA 结果进行进一步验证。其结果如图4 所示。

由图4 可知，当平均距离为3.0 时，酸浆水样品可分为3 个聚类。聚类Ⅰ共计18 个酸浆水样品，其中，引子发酵样品14 个，发酵乳杆菌发酵样品4 个；聚类Ⅱ共计10 个酸浆水样品，其中，乳酸菌发酵的样品有9 个，仅1 个样品为引子发酵；而聚类Ⅲ中2 个样品，均为发酵乳杆菌发酵浆水。由此可见，UPGMA 聚类分析的结果与PCA 基本一致，即乳酸菌纯种发酵与引子发酵的酸浆水样品在滋味和风味品质上存在明显差异。

图4 基于UPGMA 的不同发酵方式酸浆水滋味和风味品质评价Fig.4 Evaluation of the taste and flavor quality of Suanjiangshui by different fermentation methods based on UPGMA

2.3 不同发酵方式酸浆水品质与各感官指标间关系

本研究通过PCA 和UPGMA 聚类分析等多元统计学分析发现了不同发酵方式会对酸浆水的滋味和风味品质造成明显的影响。通过t检验亦发现，不同发酵方式的部分滋味和风味指标存在差异显著（P＜0.05）。为进一步探究导致酸浆水品质整体结构的不同的感官指标，本研究采用RDA 这一有监督的多元统计学方法对导致上述差异的指标进行解析，结果如图5 所示。

图5 冗余分析双序图Fig.5 Biplot of redundancy analysis

由图5 可知，W3S、W2W、W5S、W1W、W1C、W5C、W3C 和鲜味与RDA 排序约束轴上的酸浆水样品具有良好的赋值相关，即上述8 个指标代表了不同发酵方式制作酸浆水品质总体结构差异显著相关的关键指标。W3S、W2W、W5S 和W1W 位于引子发酵一侧，说明这4 个指标在加引子发酵的酸浆水中强度高于乳酸菌纯种发酵；而鲜味、W1C、W3C 和W5C 则呈现出相反的趋势。结合2.1 中结果可知，W3S、W1C、鲜味、W3C 和W5C 在两者中存在显著性差异（P＜0.05），而W2W 和W5S 差异不显著（P＞0.05）。由此可见，发酵乳杆菌纯种发酵制作的酸浆水中芳香类物质含量较高、烷烃类物质含量较低是导致其与加引子发酵方式制作的酸浆水品质差异的主要原因。

3 结论

使用电子舌、电子鼻和色度仪并结合多元统计学方法解析不同发酵方式的酸浆水品质，结果显示15 株发酵乳杆菌纯种发酵的酸浆水鲜味、芳香类风味和明亮度等指标均显著高于加引子发酵酸浆水（P＜0.05），而酸味、涩味、有机硫化物等指标强度呈现相反趋势（P＜0.05）。整体上以发酵乳杆菌纯种发酵制作的酸浆水品质更优。同时考虑到乳酸菌接菌发酵浆水品质可控性更强、成品安全性较高的特点，后期可进一步对菌株生长特性进行研究，尝试筛选互补菌株进行混菌发酵。