李卓娴,徐丽静,温小雨,孙玉浩,夏 猛 (广西中医药大学基础医学院，广西 南宁 530200)

肝癌属世界上最常见的恶性肿瘤之一[1]，为全球范围内与癌症相关的主要死亡原因，位居癌症死亡原因的第四位[2]。中国是肝癌的高发地区，据全球肿瘤流行病学统计数据显示，2012年我国肝癌发病率占全球50%[3-4]。现今对肝癌的治疗主要赖于化疗、介入治疗、手术以及综合治疗等，虽手术切除或肝脏移植可根治肝癌，但由于肝癌发病隐匿，常无特异性症状，也无明显阳性体征，而血清学检测甲胎蛋白易出现假阳性结果，准确率还有待提高[5]，且大部分肝癌患者一经诊断，多为中晚期，错过手术根治的机会。为此寻求更加有效的肝癌早期诊断方法极其必要。外泌体(exosome)是一种从细胞内向胞外分泌的拥有典型脂质双分子层膜结构的囊泡类小体[6]，携带着母细胞中多种蛋白质、脂类、DNA、RNA等重要信息并进行传递，存在于血浆、血清、羊水等多种生物体液中[7]。部分研究者发现，外泌体可参与、推动肝癌的发生发展，基于这些观察，近年来多有研究者探索外泌体功能，并试图以外泌体作为新型生物标志物，作为诊断或预后标志，尤以肿瘤领域较多[8]。甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，为现今诊断原发性肝癌特异性临床指标[9]。高尔基体跨膜糖蛋白73(GP73)是肝癌早期诊断、术后评估复发病情的理想血清标志物[10]。而超氧化物歧化酶(SOD)又名肝蛋白，是一类可催化自由基如超氧阴离子进而发生歧化反应的金属酶，通常SOD水平下降意味着衰老及死亡[11-12]。有学者研究表明，对肝癌血清标本进行生化检测，以AFP、GP73、SOD三指标共同联用有助于提高肝癌的诊断率[13]，但外泌体中相关指标是否与血液中的表达同步仍不明确，有待进一步研究。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2018年9月～2019年9月在广西中医药大学第一附属医院以及广西中医药大学附属瑞康医院住院治疗的60例原发性肝癌患者为肝癌组，60名同期健康体检者为对照组。肝癌组男38例，女22例，平均(55±6.1)岁；血清中AFP水平(671.1±87.8)ng/ml。对照组男39例，女21例；平均(52.5±8.3)岁；血清中AFP水平(8.4±0.9)ng/ml。对照组应排除其他疾病，肝癌患者均以穿刺活检或病理组织检查确诊。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2方法

1.2.1主要仪器及试剂：HT7800透射电镜(日本电子公司)；50135643超速离心机(Thermo Fisher公司)；Exo Quick-TC外泌体提取试剂盒购自美国System Biosciences Inc公司；蛋白免疫印迹法(Western印迹)测定蛋白标志物CD63、Alix，Pierce山羊抗兔IgG、Pierce山羊抗鼠IgG均购自美国Santa cruz 公司；1×PBS购自中国索莱宝公司；Bradford蛋白质浓度测定试剂盒、QuickBlock Western一抗稀释液、QuickBlock Western二抗稀释液购自中国碧云天公司。

1.2.2外周血中外泌体的分离以及鉴定：使用美国SBI公司提供的外泌体提取试剂盒，分别收集了肝癌组、对照组的血浆样品，用以分离外周血外泌体，遵循试剂盒使用说明严格操作。以进一步通过Western印迹法检测外泌体表面蛋白标志物Alix、CD63的表达，分析外泌体的分泌水平，以透射电子显微镜观察外泌体形态。

1.2.3乙酰胆碱酯酶(AchE)实验测定外泌体浓度：采用AchE法可对纯化的外泌体进行定量[14-15]，以100 mM双硫代硝基苯甲酸(DTNB)作颜色指示剂，其于4℃条件可保存两周；1 ml 1×PBS中制备28.9 mg碘代硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine iodide)作底物，于-20℃条件可保存1个月。将10 ml 1×PBS、200 μl底物、500 μl DTNB混合制备显色剂。将50 μl的外泌体样品添至96孔板中，使用AchE浓度从0.98～2 000 mU/ml制成标准曲线。将50 μl标准溶液添至单独的孔中，再将200 μl显色剂添入所有的孔中。等待20 min孵育，使用酶标仪在A450 nm波长测量AchE的吸光度值，依据标准曲线、样品体积计算浓度。

1.3分析评估AFP、GP73、SOD的表达水平:使用电化学发光法、酶联免疫吸附法等方法测定血浆、外泌体中AFP、GP73、SOD的表达水平。通过检测外周血和外周血外泌体中AFP、GP73、SOD表达水平，分析外泌体中相关指标是否与血液中相关指标的表达同步。

1.4统计学处理:所有数据选取SPSS23.0统计软件处理，计量资料组间比较使用独立样本的t检验验证；计数资料组间比较使用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1外周血中外泌体的分离、鉴定:Western印迹法检测外泌体标志蛋白Alix、CD63的表达水平见图1；使用透射电镜观察外泌体形态，电镜下可见提取的外泌体呈现圆形或椭圆形，大小不均，具备着明显的膜性结构，见图2。

图1 外泌体标志蛋白Alix、CD63表达

2.2外泌体含量在肝癌患者外周血中增加：使用AchE法检测外泌体浓度，并已通过Western Blot确认了外泌体的身份。经AchE测定肝癌组及对照组的血浆样本中的外泌体浓度发现，肝癌组的外泌体浓度为(376.02±55.0)mU/ml，高于对照组的(184.4±17.1)mU/ml，外泌体的释放量高，差异具有统计学意义(P<0.001)。见图2A。Western Blot分析表明两组外泌体样本中的外泌体标志蛋白Alix、CD63的表达存在差异，肝癌组外泌体中Alix、CD63的表达高于对照组。见图3。

图2 电镜下外泌体形态结构

图3 两组外泌体标志蛋白表达差异

2.3AFP、GP73、SOD在血浆、外泌体中的表达

2.3.1AFP在血浆、外泌体中的表达水平差异:对照组中AFP在血浆、外泌体中的表达水平均低于肝癌组，差异有统计学意义(P<0.001)；肝癌组中，AFP在血浆中的表达水平高于其在外泌体中的表达水平，差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 AFP 在血浆、外泌体中的表达水平差异

2.3.2GP73在血浆、外泌体中的表达水平差异:对照组中GP73的表达水平均低于肝癌组，差异有统计学意义(P<0.001)；肝癌组中，GP73在血浆中的表达水平高于其在外泌体中的表达水平，差异有统计学意义(P<0.001)。见表2。

表2 GP73在血浆、外泌体中的表达水平差异

2.3.3SOD在血浆、外泌体中的表达水平差异:对照组中SOD的表达水平均高于肝癌组，差异有统计学意义(P<0.001)；肝癌组中，SOD在血浆中的表达水平高于其在外泌体中的表达水平，差异有统计学意义(P<0.001)。见表3。

表3 SOD在血浆、外泌体中的表达水平差异

3 讨论

原发性肝癌(HCC)是一类多病因相关且广泛流行的癌症，为全球癌症死亡的第四大原因[16]。肝癌的发病隐匿，早期常无特异性症状、阳性体征，通常在诊断时，约70%的患者已为晚期肝癌[17]，能够根治肝癌治疗方法是手术切除，但因大部分患者诊断肝癌时已为晚期，错过了手术机会，寻求辅助肝癌早期诊断的手段及方法仍是当前亟待解决的关键问题。

目前临床上多采用血清AFP作为诊断方法[18]，但其敏感性及特异性不高，容易被漏诊误诊[19]，相关研究提示，AFP、GP73、SOD三者联用的方法具有提高肝癌的诊断率的作用[19]。

AFP是一种糖蛋白，正常成年人血清中含量尚不到20 μg/L，当肝细胞发生癌变、病情恶化时，AFP在血清中的含量会急剧增加，因此AFP就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标，可见在大约80%的肝癌患者血清中升高。但AFP对早期肝癌患者的阳性率仅为50%～60%[20]，且不易与肝炎、肝硬化等进行区分，大程度限制了肝癌的早期诊断。检索现有文献发现，虽血清AFP可作肝癌诊断指标之一，但从外泌体中AFP含量变化探讨外泌体中AFP在肝癌诊断和治疗作用的研究尚未见报道，因此有必要进一步探讨外泌体中AFP含量，以进一步明确外泌体在肝癌诊断和治疗评价中的作用和意义。

GP73是新兴出现的对肝癌早期诊断和术后复发病情评估的理想血清标记物[21-22]。GP73通常在肝细胞中几乎不表达，但发生病变时若受病毒感染，其表达可显著高于正常肝组织3～5倍。赵运胜等[23-24]研究发现，原发性肝癌患者血清GP73水平显著高于肝硬化和正常对照组，且其敏感性和特异性高于AFP。另有肝癌土拨鼠模型研究[25]发现，模型组GP73水平显著高于正常对照组，说明GP73表达异常与肝癌有密切关系。更有相关研究[26]表明，GP73的敏感性、特异性远高于40年前问世的AFP，可高达95%及74%，若联合检测将大幅提升肝癌诊治水平。

SOD又名肝蛋白，是人体内重要的抗氧化活性物质，通常SOD水平下降意味着衰老及死亡。肝癌患者机体内存在大量具有超氧化作用的活性氧[26]。活性氧又被称为机体垃圾，一旦过剩存在便会引起多种氧化应激反应，进而损伤细胞，甚至造成细胞死亡。在肝细胞中SOD的活性最高，SOD可以与氧自由基造成的损害相对抗，并将过剩的氧自由基及其衍生物消除使细胞免受伤害，进而发挥抑制肿瘤生成的作用。研究表明[13]肝癌组SOD水平显著低于肝硬化组和对照组，且在原发性肝癌的诊断中，AUC为0.791，可见SOD水平检测用于原发性肝癌诊断具有一定的可行性。

近年来，外泌体作为包括癌症在内的不同疾病的新型生物标志物受到了越来越多的关注[27]。外泌体是一种由细胞向胞外分泌的囊泡类小体，可存在于多种生物体液中，可携带着多种蛋白质、DNA及RNA等重要信息在细胞-细胞间进行物质、信息的传递，同时外泌体存在于血液、汗液、尿液等体液中，取材相对简单方便，使得外泌体可成为液体活检的理想工具[28]。此外，外泌体在肝癌的发生、发展过程中有重要作用，而血清诊断指标AFP、GP73和SOD均有可作为外泌体诊断和治疗评价的潜在指标，本研究在此基础上进一步探讨外泌体及其内涵的AFP、GP73和SOD等联合检测在肝癌诊断中的作用，对于开发肝癌新的诊断工作和方法具有重要意义。

本次研究通过对临床病例采用观察发现，提取的外泌体Alix、CD63表达显著，且在电镜下观察到了外泌体的形态结构，确定该方法提取的外泌体可靠，且分析结果显示肝癌组外泌体中AchE、Alix、CD63含量高于对照组，因此判定肝癌患者中外泌体释放量高于对照组。经电化学发光法、酶联免疫吸附法等检验发现，AFP、GP73在肝癌中的表达俱呈现上升趋势，且在血浆中的表达均高于其在外泌体中的表达。SOD则在肝癌中呈现下降趋势，其在血浆中的表达水平高于外泌体中的表达水平，AFP、GP73、SOD等三指标在血浆及外泌体中的趋势均呈同步状态。

外泌体作为新型的一种分子实体，能辅助肝癌的早期诊断，具有微创、敏感度高、特异性强等优势，且具有更高的稳定性，随着外泌体提取、检测技术的发展，外泌体检测将会具备更加良好的发展前景。此次研究表明，血清诊断指标AFP、GP73、SOD有望成为外泌体诊断肝癌及治疗评价的潜在指标，外泌体诊断肝癌具备准确、快速、微创、高稳定性等优势。