尹曼莉，王耀宏，宋之言

上海兰玛生物材料有限公司（上海，200444）

0 引言

同种异体骨移植是目前临床骨修复手术常用的方式，多年来受到广泛关注。大量临床应用证实同种异体骨移植的成功率接近自体骨［1-2］。随着同种骨的大量应用，越来越多的新品种和制备工艺得到不断完善和创新，尤其是脱矿骨基质（demineralized bone material DBM）。DBM 是一种经稀酸脱钙、清洗、冷冻干燥等一系列处理的动物或人类骨，骨基质的成分主要为I 型胶原蛋白、少量的非胶原蛋白和各种细胞因子，已经在骨科［3-4］和口腔科［5］领域得到了广泛应用。

DBM 系列产品，包括脱矿骨粉、脱矿骨纤维、脱矿骨胶等。每种产品的诱导能力不同［6-7］，其中骨纤维作为一种新型DBM，具有良好的骨诱导能力。因此在脊柱融合［8-13］、创伤［14-16］和口腔［17］领域均应用良好。

1965 年Marshall Urist，M.D.详细描述了骨诱导的过程［18］，而裸鼠异位成骨实验已经被成功运用于证明骨诱导活性。我们旨在通过裸鼠异位植入试验，研究本公司自主研发的脱矿骨纤维的骨诱导活性。

1 材料与仪器

主要材料：人类皮质骨

主要仪器：数控机床、骨锯、骨钻、精密恒温培养箱、超声清洗机、摇床、冷冻干燥机、切片机、光学显微镜等。

2 方法

2.1 材料制备

首先去除皮质骨上的软组织，经初洗后，利用定制的专用工具制备骨纤维，利用盐酸脱矿，脱矿后超声清洗，最后经冷冻干燥后铝箔封口包装，γ 射线辐照灭菌备用。

2.2 实验动物

6 只6～9 周的裸小鼠，在裸鼠腿部肌肉内植入脱矿骨纤维。

2.3 手术方法

使用异氟醚将动物麻醉，将麻醉后的动物以俯卧姿势置于操作室洁净操作台上，并将其固定。用碘液在裸鼠背部、腰部区域进行擦拭，然后使用无菌纱布将碘液擦除。小心提起裸鼠背部腰处脊柱上方的皮肤，慢慢切开0.5 ～1 cm 长的切口。将皮肤切口小心撕开，然后使用钝性器械剥离，在臀中肌组织中沿着平行于肌肉纤维的方向，打造出一个小袋状空隙模型，注意操作过程避开血管。在空隙模型中植入实验样品，手术完毕后缝合肌肉皮肤。分别在植入2 周、4 周各处死三只后取材，进行标本大体观察、肉眼观察和组织切片观察。

2.4 术后观察

术后观察裸鼠切口反应、活动、饮食情况以及有无炎症。

2.5 组织形态学观察

根据设计的不同时间段取材，取材后将标本放置于中性缓冲福尔马林的组织盒中，福尔马林组织液需完全浸没标本，固定至少72 h，然后进行脱钙、脱水、石蜡包埋并进行修整。另外，包埋前注意将样本沿长轴对半切开，并将剖面朝下进行组织块包埋。用组织切片机切成5 μm 厚切片，载玻片上展开并制作切片，进行HE 染色，最后用光学显微镜观察。

3 结果与讨论

3.1 术后观察结果

试验动物在观察期间饮食、活动均正常，试验动物伤口未见肿胀，未见脓性液体渗出。2 周、4 周取材时伤口愈合良好，植入材料被纤维结缔组织紧密包裹，形成包块，周围肌肉未见水肿、坏死等不良反应。

3.2 组织学切片观察结果

组织学观察到术后2 周（图1A、图1B）植入物被少量纤维组织包绕，大量成纤维细胞及间充质细胞聚集，炎症细胞少见，有新生血管形成（白箭头），可见新生软骨（黄箭头）样骨化。4 周（图1C、图1D）时，组织块被薄层结缔组织包绕，炎症细胞少见，新生血管（白箭头）组织丰富，可见多个新骨形成区。可观察到，新骨已成熟，膜内成骨活跃，骨髓丰富（脂肪、血细胞、浆细胞）；骨髓腔壁上排列整齐的成骨细胞，也有软骨（黄箭头）形成。软骨成骨位于纤维内或纤维间，周围有大量趋化聚集的间充质细胞及新生血管。

图1 脱矿骨纤维复水前和复水后Fig.1 Images of demineralized bone fibers before and after rehydration

3.3 讨论

一个理想的骨修复材料必须具备三个关键因素：细胞、支架和生长因子，它们分别起到骨形成、骨传导和骨诱导的作用。该种脱矿骨纤维经精确控制脱矿，暴露骨材料中被无机成份遮盖的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），具有适宜的钙含量有利于新骨形成过程中的钙盐沉积。因特殊工艺使骨纤维是沿皮质长骨的径向剥脱而成，因此每根骨纤维都含有数个完整及非完整的哈氏系统（50 μm）结构，便于植入后宿主间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的侵入及毛细血管的长入，为骨传导创造了良好的微环境。该产品是由纯皮质骨制成，其胶原蛋白密度、非胶原蛋白密度均高于松质骨，因此比由松质骨制成的脱矿骨粉具有更好的骨诱导性能。另外，脱矿骨纤维的细长结构，可吸附更多定向成骨前体细胞及MSC 的吸附、增殖和分化，短时间内（8～12 周）在植入骨的整个区域内大量成骨。因此相比松质骨约24 周的取代过程，更易早期形成骨掺入，达到骨愈合。当骨纤维植入裸鼠肌肉内，骨纤维内暴露的BMPs 与未分化的MSC 表面受体结合，使MSC 在结构和功能上发生改变，首先分化成为成骨细胞前体细胞，然后前体细胞再分化成为成熟的骨细胞，再通过软骨成骨和膜内成骨两种方式形成新骨。本实验中制备的脱矿骨纤维样品植入裸鼠4 周就可以发现有新骨形成，有力证实了该骨纤维具有明显的骨诱导活性。

4 结语

目前具备骨传导的材料众多，比如磷酸三钙、生物玻璃等。但具备骨诱导的材料很少。脱矿骨纤维不仅具有明显的诱导成骨能力，而且还具备特有的自然卷曲及相互缠绕作用，复水后可任意塑形，操作方便。目前在美国已经成为DBM 应用的主要形态, 但国内尚无此产品。作者认为该产品有望成为一种理想的骨科修复填充材料，亦会继续跟进研究。