毕婉君，郑玉成，柳镇章，陈 彬，邓慧莉，胡清财，孙 云

（福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002）

乌龙茶是我国六大茶类之一，属半发酵茶，其主产区分布在闽南、闽北、广东及中国台湾地区，其外形具有特殊的绿叶红镶边，滋味醇厚甘爽，香气馥郁芬芳，因此深受消费者喜爱。香气是鉴定乌龙茶品质的重要指标之一，同时也是吸引广大消费者进行购买的重要因素之一。不同等级乌龙茶香气品质化学的科学研究，包括香气组分、香气特征和香气检测技术等尤为重要。

近几年来，茶叶香气成分测定的方法有很多，常见的包括固相微萃取法、水蒸气蒸馏法、静态顶空法等。相比于目前使用较多的香气检测方法，全自动热脱附-气相色谱-质谱（automatic thermal desorption-gas chromatography-mass spectrometry，ATD-GC-MS）是一种通过吸附材料对大气中有机物质进行吸附后，在一定温度下进行脱附，然后通过载气将这些挥发性化合物带入气相色谱-质谱进行测定的技术，此方法步骤简单，省去了中间操作环节，能够极大提高检测的灵敏度，能更准确、真实地反映香气成分的组成情况。目前，已广泛用于环境、植物、风味食品中挥发性物质的检测，但在茶叶香气物质检测上却鲜见有相关报道。因此，对ATD-GC-MS香气检测方法进行优化并应用于茶叶香气检测，可以更好地反映感官审评中香气特征的结果，有利于茶叶香气研究领域的进一步发展。

偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）是通过对数据“降维”的同时，建立回归模型，对回归结果进行判别分析并实行分类的多变量统计分析方法。PLS-DA建立了代谢物表达量与分组关系之间的模型，可弥补主成分分析方法的不足，更好地获取组间差异信息，还可以对样品的分组进行预测。目前，PLS-DA已广泛应用于代谢组学中，用于快速鉴别不同品种、不同产地、不同等级等的样品。

本实验对茶叶挥发性成分影响较大的吸附温度、吸附时间、冷阱温度因素进行优化分析，以总峰面积作为主要的考察指标开展单因素试验和响应面分析，从而获得最优萃取条件，以期开展ATD-GC-MS检测方法在肉桂乌龙茶上的应用。同时对不同等级的肉桂乌龙茶风味进行对比分析，并使用PLS-DA进行风味预测，以期为肉桂乌龙茶的等级判别提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉桂乌龙茶（分析方法优化使用） 武夷山卓享茶业有限公司；特级、一级、二级肉桂乌龙茶（生产日期2021年5月） 武夷星茶业有限公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-TQ8040气相色谱质谱联用仪 日本岛津公司；AutoTD自动热脱附-解吸仪（配有内装150 mg Tenax-TA吸附剂的吸附管） 成都科林分析技术有限公司；QC-1S大气采样仪 北京市科安劳保新技术有限公司；HWS-28型电热恒温水浴锅 深圳天溯计量检测股份有限公司；聚四氟乙烯管、聚四氟乙烯薄膜 大金氟化工（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官审评

由5 位乌龙茶审评专家按照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》中的乌龙茶盖碗审评法对3个等级的肉桂乌龙茶进行感官审评，其中各项占比为外形20%、汤色5%、香气30%、滋味35%、叶底10%。

1.3.2 样品处理

取5.00 g肉桂乌龙茶样品（或不同等级的肉桂乌龙茶样品）（精确至0.001 g）至自制顶空瓶中，将顶空瓶用聚四氟乙烯薄膜进行密封，在一定温度的水浴锅中平衡10 min，使用聚四氟乙烯管连接老化过的Tenax-TA吸附管和顶空瓶，用大气采样仪以200 mL/min的流速进行平行采样。挥发性气体提取完成后，立即用聚四氟乙烯盖密封吸附管两端，送至实验室进样检测。

1.3.3 自动热脱附-解吸仪条件

一级解吸温度250 ℃；一级解吸时间5 min；二级解吸温度300 ℃；阀温度200 ℃；运输线温度200 ℃；冷阱加热时间3 min；进样时间60 s；循环时间50 min；载气为高纯氦气（纯度≥99.999%）；载气压力60 kPa；驱动气体为空气。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：Rtx-5MS毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃，保持5 min，再以30 ℃/min升至240 ℃，保持8 min；载气（He）流速3 mL/min，压力49.5 kPa；分流比5∶1。

1.3.5 质谱条件

电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；质量扫描范围/28～500。

1.3.6 挥发性化合物定性和定量

通过MS全离子扫描模式下的总离子流色谱图，依据色谱保留时间、质谱信息和NIST 08标准谱库比对结果相结合的方法进行定性分析；采用气相色谱峰面积归一法进行定量。

1.3.7 单因素试验优化

1.3.7.1 吸附时间对萃取效果影响

保持肉桂乌龙茶样品质量5.00 g、吸附温度60 ℃、冷阱温度-10 ℃及其他条件不变，分别在吸附时间为10、20、30、40、50 min的条件下，检测化合物数量和总峰面积，考察吸附时间对肉桂乌龙茶香气检测的影响。

1.3.7.2 吸附温度对萃取效果影响

保持肉桂乌龙茶样品质量5.00 g、吸附时间30 min、冷阱温度-10 ℃及其他条件不变，分别在吸附温度为30、45、60、75、90 ℃的条件下，检测化合物数量和总峰面积，考察吸附温度对肉桂乌龙茶香气检测的影响。

1.3.7.3 冷阱温度对萃取效果影响

保持肉桂乌龙茶样品质量5.00 g、吸附时间30 min、吸附温度60 ℃及其他条件不变，分别在冷阱温度为-30、-10、10 ℃的条件下，检测化合物数量和总峰面积，考察冷阱温度对肉桂乌龙茶香气检测的影响。

1.3.8 响应面试验优化

在单因素试验的基础上，采用Design Expert 8.0.6软件设计响应面试验，因素与水平见表1。选择优化后的ATD-GC-MS条件，对肉桂乌龙茶进行3 次重复实验测定其重现性。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Coded and corresponding actual levels of independent variables used in response surface design

1.4 数据处理

所有实验均进行3 次平行测定，使用Excel进行数据整理和图表绘制；使用SPSS 19.0软件的Duncan最小显著差异法对数据进行差异显著性分析；使用Design Expert 8.0.6统计软件进行响应面试验中的回归分析；使用SIMCA-P 11.5软件对ATD-GC-MS数据进行PLS-DA；使用TBtool制作热图。

2 结果与分析

2.1 ATD-GC-MS条件的单因素试验优化

2.1.1 吸附时间对吸附效果的影响

香气物质进入吸附管后，达到平衡和吸附时间有关，吸附时间越长，附着在吸附管的化合物就越多，但时间过长会使前面吸附的化合物脱附。如图1所示，随着吸附时间的延长，总峰面积呈先上升后略有下降的趋势，在30 min总峰面积达到最高。另外，检测出的化合物数虽呈现逐渐增加的趋势，但是在30～50 min没有明显增加。原因可能是香气化合物的吸附量在萃取初始阶段迅速增加，并在30 min左右吸附量基本达到饱和，再继续延长吸附时间会导致挥发性组分发生解吸且成本增加。综上，选择最佳的吸附时间为30 min。

图1 吸附时间对肉桂乌龙茶挥发性化合物萃取的影响Fig. 1 Effect of adsorption time on the extraction of volatile compounds from Rougui oolong tea

2.1.2 吸附温度对吸附效果的影响

香气物质进入吸附管后，达到平衡状态与吸附温度有关，吸附温度升高会加速挥发性成分分子的运动，有利于化合物的挥发，但是吸附温度过高容易降低吸附管吸附挥发性物质的能力。如图2所示，随着吸附温度的升高，总峰面积和化合物数都呈先升高后下降的趋势，在60 ℃时达到最高。原因可能是吸附伴随着解吸现象，解吸速率会随着温度的升高加快，当解吸速度大于吸附速度时，会导致吸附的化合物和峰面积减少，同时存在重复性差、不稳定及香气物质发生变化的问题。综上，选择最佳的吸附温度为60 ℃。

图2 吸附温度对肉桂乌龙茶挥发性化合物萃取的影响Fig. 2 Effect of adsorption temperature on the extraction of volatile compounds from Rougui oolong tea

2.1.3 冷阱温度对吸附效果的影响

冷阱温度是热脱附冷阱聚焦功能的一个关键参数，冷阱温度可以降低系统误差、提高仪器灵敏度以及改善谱带展宽问题。如图3所示，随着冷阱温度的降低，化合物数和总峰面积明显增加，这说明热脱附仪中冷阱温度越低，对香气组分的富集作用越强。所以，在仪器条件允许范围内，采用-30 ℃的冷阱温度进行分析。

图3 冷阱温度对肉桂乌龙茶挥发性化合物萃取的影响Fig. 3 Effect of cold trap temperature on the extraction of volatile compounds from Rougui oolong tea

2.2 ATD-GC-MS条件的响应面优化

2.2.1 响应面优化试验结果

在单因素试验的基础上进行响应面优化试验，结果见表2。本试验共有15个试验点，1～12是析因试验点，13～15是零试验点，其中析因点为自变量在、、所构成的三维顶点，零点为区域的中心点。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface design and experimental response

2.2.2 模型方程的建立与显著性检验

为了直观反映吸附温度（）、吸附时间（）、冷阱温度（）3个影响因素之间的交互作用对总峰面积（）的影响，利用Design Expert 8.0.6软件绘制了各因素与响应值之间的三维曲面图和等高线分析图（图4）。

图4 各因素交互作用对肉桂乌龙茶挥发性化合物总峰面积的影响Fig. 4 Response surface and contour plots showing individual and interactive effects of variables on the total peak area of volatile compounds of Rougui oolong tea

使用Design Expert 8.0.6软件，对表2的试验结果进行多元回归拟合，得到总峰面积与各因素的二次多元回归方程：

对回归模型进行方差分析和回归系数显著性检验，结果见表3。由此看出：模型＝49.03、＝0.000 2＜0.01，表明模型极显著；失拟项＝3.76，＝0.217 1＞0.05，说明模型的失拟度不显著；同时模型的决定系数为0.988 8，调整后为0.968 6，说明该模型能解释96.86%响应值的变化，表明该模型拟合程度良好，可以用于ATD-GC-MS萃取乌龙茶香气条件优化的理论预测。

对模型进行回归方程系数显著性检验可知：一次项显著（＜0.05）且、极显著（＜0.01），说明各个因素对总峰面积有显著影响；交互项显著（＜0.05）且极显著（＜0.01），二次项、极显著（＜0.01），说明各个因素对总峰面积的影响不是简单的线性关系；在所选取的因素水平范围内，各因素对结果的影响排序：＞＞。

表3Box-Behnken试验结果的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

2.2.3 最佳萃取条件的预测和验证

通过Design Expert 8.0.6软件对回归方程求解，在试验的因素水平范围内预测ATD-GC-MS萃取肉桂乌龙茶的最佳条件为吸附温度54.63 ℃、吸附时间37.4 min、冷阱温度-28.99 ℃，在此条件下检测出的总峰面积可达1.752 36×10。考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为吸附温度55 ℃、吸附时间37 min、冷阱温度-29 ℃。在此条件下，实际测得的平均总峰面积为1.785 64×10，实测值是理论值的98.11%，说明使用此回归方程对ATD-GCMS萃取肉桂乌龙茶香气进行分析和预测可行。

2.3 不同等级的肉桂乌龙茶香气物质分析

2.3.1 不同等级肉桂乌龙茶感官审评结果

对3个等级的肉桂乌龙茶进行感官审评，从外形、汤色、香气、滋味和叶底5 项因子综合评价，结果见表4。感官审评结果表明，香气特征上，特级肉桂乌龙茶馥郁持久，花果香明显，似有乳香；一级肉桂乌龙茶花果香明显，似蜜桃香；二级肉桂乌龙茶花果香略带火香。

2.3.2 不同等级肉桂乌龙茶香气物质的ATD-GC-MS分析

基于优化后的条件，对3个等级肉桂乌龙茶样品进行香气成分分析，得到各个样品的总离子流图（图5），共有香气成分见表5。从3个等级肉桂乌龙茶中共鉴定出香气成分173种，从特级、一级、二级的肉桂乌龙茶样品中分别鉴定出143、126、134种香气成分，共有香气成分90种，鉴定出醇类、酯类、醛类、酮类、烷烃类、烯烃类、芳香烃类和其他化合物，共8 类香气成分。

表4 3个等级肉桂乌龙茶感官审评结果Table 4 Sensory evaluation results of three grades of Rougui oolong tea

表5 3个等级肉桂乌龙茶共有香气物质的ATD-GC-MS成分鉴定Table 5 ATD-GC-MS identification of aroma compounds common to three grades of Rougui oolong tea

续表5

续表5

图5 3个等级肉桂乌龙茶总离子色谱图Fig. 5 Total ion chromatograms of aroma compounds in three grades of Rougui oolong tea

如图6所示，特级和一级肉桂乌龙茶香气成分中醇类的峰面积最高，分别为5.77×10和4.58×10，皆极显著高于二级肉桂乌龙茶；二级肉桂乌龙茶香气成分中芳香烃类的峰面积最高（3.60×10），且显著高于其他两个等级。另外，特级肉桂乌龙茶的醛类物质峰面积极显著高于一级和二级肉桂乌龙茶，酯类和烷烃类物质在3个等级肉桂乌龙茶中的峰面积没有显著差异。可见3个等级肉桂乌龙茶的香气成分在化学组成和含量上存在一定的差异。

图6 3个等级肉桂乌龙茶8 类香气的峰面积Fig. 6 Peak areas of eight categories of aromatic constituents in three grades of Rougui oolong tea

2.3.3 不同等级肉桂乌龙茶香气成分的偏最小二乘法判别分析

PLS-DA变量重要性因子（variable important for the projection，VIP）值可以量化每个变量对样品分类的贡献，VIP值越大，变量在判别过程中贡献越大，通常认为VIP＞1的变量是模型的重要代谢标志物。实验结果得出，有47个香气组分VIP＞1，可作为区分3个等级肉桂乌龙茶的重要代谢标志物。

图7 3个等级肉桂乌龙茶挥发性化合物PLS-DA二维得分图Fig. 7 PLS-DA score plot of volatile compounds in three grades of Rougui oolong tea

图8 3个不同等级肉桂乌龙茶挥发物PLS-DA交叉验证结果Fig. 8 PLS-DA cross-validation results of volatile components in three grades of Rougui oolong tea

2.3.4 不同等级肉桂乌龙茶关键香气成分的聚类分析

为了直观地展示47种关键香气成分（VIP＞1）在3个等级肉桂乌龙茶的分布规律，采用层序聚类分析对这些关键香气成分进行了分析（图9）。结果显示，特级肉桂乌龙茶中癸醛、壬醛、硬脂二醇、乙酸仲丁酯、乙酸丁酯、甲苯、芳樟醇、正辛醛、甲基丙烯酸甲酯、2,6-二甲基环己醇、正戊烷、苯甲醇、正已醛、苯甲醛、1-戊烯-3-醇、()-2-戊烯-1-醇、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、正戊醛、3,5-辛烷-2-酮、二甲醇缩甲醛、(1,3)-反式-4-蒈烯、3-辛烯-2-酮含量较高；一级肉桂乌龙茶中正十八烷、萘、正辛腈、异戊醛、3,5,5三甲基己酸环己基酯、反式-四氢呋喃-2,3-二甲基-2-呋喃醇、乙酸甲酯、醋酸、糠醛含量较高；而二级肉桂乌龙茶中十四烷、2,6,11-三甲基十二烷、-法尼烯、正十七烷、乙醇、邻二甲苯、双戊烯、茶呲咯、月桂烯、正丁醇、2,5-二羟基苯甲醛、异佛尔酮、丙烯酸异辛酯、(,)-2,4-庚二烯醛含量较高。这些挥发物是区分不同等级肉桂乌龙茶的重要物质，表明肉桂乌龙茶的挥发物具有显著的等级特征。

图9 3个等级肉桂乌龙茶挥发物的热图及层次聚类图Fig. 9 Heatmap obtained from HCA analysis of volatile components in three grades of Rougui oolong tea

3 讨论与结论

香气是决定茶叶品质的重要因子。ATD-GC-MS技术作为一种高效的香气检测方法，应用在茶叶香气物质的检测上可以更加真实准确地反映茶叶香气品质。本研究采用单因素试验和Box-Behnken响应面分析优化了ATDGC-MS检测肉桂乌龙茶香气的方法，以峰面积为主要的评价指标，得到肉桂乌龙茶最优萃取条件为吸附时间37 min、吸附温度55 ℃、冷阱温度-29 ℃，此时萃取的物质峰面积为1.785 64×10。在该条件下，肉桂乌龙茶中的风味物质能更好地挥发、吸附和解吸，检测出的挥发性化合物种类较多，峰面积大。

在最优萃取条件的基础下，对3个等级肉桂乌龙茶样品进行香气成分分析，发现不同等级肉桂乌龙茶的香气成分在化学组成和含量上存在一定的差异。基于3个等级肉桂乌龙茶香气成分的峰面积，建立了PLS-DA模型并筛选出47种关键香气成分（VIP＞1）。特级肉桂乌龙茶含量较高的关键香气成分主要以具有愉悦花果香的醇类、醛类等为主，比如芳樟醇有铃兰香，苯甲醇有花香，1-戊烯-3-醇、正辛醛有水果香，1-辛烯-3-醇有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气，癸醛有甜香、柑橘香、蜡香、花香，壬醛有玫瑰、柑橘、油脂气味和很强的水果香味，正己醛有青草、苹果、油脂气味，苯甲醛有苦杏仁、樱桃及坚果香等；在一级肉桂乌龙茶含量较高的关键香气成分中，异戊醛有苹果香气或桃子香气，乙酸甲酯有芳香味，糠醛有特殊花香；在二级肉桂乌龙茶含量较高的关键香气成分中，-法尼烯有花果香，月桂烯有甜橘味和香脂气，双戊烯有好闻的柠檬香味，茶吡咯有烘炒香，正丁醇有酒味，异佛尔酮有樟脑、薄荷香味，乙醇、邻二甲苯有独特香气。结合感官审评的结果，特级肉桂乌龙茶的香气馥郁持久，花果香明显，似有乳香，推测与特级肉桂的特征香气成分丰富、带有花果香以及有油脂气味有关；一级肉桂乌龙茶的香气花果香明显，似蜜桃香，推测与其特征香气成分带有花果香、桃子香有关；二级肉桂乌龙茶的香气呈现花果香略带火香，推测与特征香气成分带有花果香、烘炒香有关。另外，在47种关键香气成分中还有一些物质本身不具有特殊的香气，但是可能和其它香气物质间有互作效应，共同参与茶叶香气的构成，推测这些物质共同互作效应对不同等级肉桂乌龙茶香型的组成有重要贡献。徐邢燕采用顶空固相微萃取-气相色谱-飞行时间质谱技术发现高等级肉桂茶的-法尼烯、吲哚的相对含量高于低等级肉桂茶，而庚二烯醛、间二甲苯、呋喃类、烯烃类、大部分酮类香气物质低于低等级茶。邱晓红等采用质子传递反应-飞行时间质谱与气相色谱-质谱联用技术对比水仙和肉桂香气成分，发现肉桂的特征性成分是反式橙花叔醇、-法尼烯、苯甲醛。陈林等基于同时蒸馏萃取-气谱-质谱技术发现了肉桂特有香气成分，为苯甲醛、4-溴-1-环己烷、芳樟醇、苯乙腈、()-己酸-3-己烯酯、()-3-己烯醇苯甲酸酯和6种未知化合物，并与顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术对比，发现不同萃取方法对香气成分的检出存在良好的互补作用。由于本实验所使用的肉桂乌龙茶样品量较少，因此会影响香气评价模型的普适性，所以后续研究需进一步增加实验样品，提高该香气评价模型的准确性和可靠性。

本研究优化了ATD-GC-MS检测肉桂乌龙茶香气的方法，结合化学计量法初步分析了肉桂乌龙茶香气成分的等级差异，并能够筛选出其中的特征挥发性物质。在后续研究中，将进一步探究更好的茶叶香气检测方法。另外，茶叶香气成分种类和形成途径复杂多样，不同香气化合物有其特定的理化性质和香味阈值，如何深入地挖掘和调控在乌龙茶加工过程中有明显规律性变化的特征性香气成分仍有待于进一步研究。