唐 林，郭柯宇，赖鲸慧，李建龙，李 琴，杨 勇，邹立扣，刘书亮,3,*

（1.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2.四川农业大学资源学院，四川 成都 611130；3.四川农业大学食品加工与安全研究所，四川 雅安 625014）

猪肉是我国主要的肉类食品之一，2019年全球猪肉消费量达到1.009亿 t，其中我国猪肉消费量（4 486.6万 t）约占全球猪肉消费量的49%，即使受到非洲猪瘟和新冠肺炎疫情的影响，我国猪肉消费量在全球范围内仍处于绝对领先的地位。然而，从生猪到餐桌供应链的微生物安全却存在风险。生猪体表带有大量尘埃、杂质以及病菌等，刺杀放血、烫毛、开膛劈半、去内脏等环节都容易造成猪肉中微生物增加，并且许多食源性致病菌主要存在于猪的呼吸道和胃肠道中，商业屠宰期间的烧灼过程并不能消除这些细菌，清洗反而会使这些细菌污染整个胴体。分割过程由于肉块与外界的接触面变大也容易造成严重的交叉污染。因此，调查屠宰分割过程中猪胴体表面的微生物污染情况，找出关键污染环节并加以控制，对减少猪胴体的交叉污染和提高企业经济效益非常重要。

肉类微生物的研究方法主要有传统培养和分子生物学技术。传统培养方法操作简单、能较直观地反映微生物数量，但由于选择性生长、营养条件等限制，无法完整反映样品的菌相组成。高通量测序（highthroughput sequencing，HTS）技术针对样本中细菌16S rRNA、真菌18S rRNA或ITS特定区域进行扩增，克服了偏向培养和及时DNA克隆的限制，能够同时分析多个样品，也能够深入描述样本微生物群落组成和相对丰度，已广泛应用于微生物多样性与群落结构组成研究。尽管传统培养方法显示出一些缺点，但在分离、鉴定食品腐败微生物时仍必不可少。Illikoud等通过传统培养方法从变质食品及屠宰场环境中分离出161 株热死环丝菌并进行鉴定。Zhao Shengming等通过总活菌数、假单胞菌数、热死环丝菌数和肠杆菌科数等确定猪肉变质程度，以及不同保鲜剂对冷却猪肉的保鲜效果。通常认为，活菌计数达到7～8（lg（CFU/g））会导致肉的微生物腐败，但这仅具有参考价值，因为计数时包括潜在的保护性细菌，分析食品的腐败还需要评估到属、种水平。因此，在实际应用中多采用传统培养与HTS相结合的方法分析样本菌相。Yang Chao等分别通过传统培养计数和HTS技术研究经防腐剂处理后在4 ℃贮存期间猪肉细菌数和优势菌群结构的变化。Li Xinfu等通过HTS监测真空包装腊肉在冷藏过程中的微生物组成和种群动态变化，并通过传统培养方法对特定腐败微生物进行分离鉴定，明确了造成腊肉腐败的主要微生物。Cauchie等对不同来源和贮存条件的288 份猪肉末样品进行16S rRNA扩增子测序与耐冷菌、乳酸菌计数，发现组合方法在猪肉碎样品的微生物动力学分析方面提供了互补结果。Peruzy等对猪肉糜中微生物群落的分析结果也表明，使用16S rDNA测序进行分离株鉴定以及16S rRNA扩增子测序分析整体群落可以提供互补结果。因此，HTS技术与传统培养方法相结合，可以更详细地解析肉类环境中微生物的群落组成及其复杂关系。

本实验通过传统培养方法和HTS技术相结合分析生猪屠宰链不同环节猪胴体表面的微生物污染情况，测定屠宰车间刀具和分割车间各接触面细菌菌落总数，确定屠宰分割过程中的关键污染环节，以期为减少屠宰分割过程中猪胴体的交叉污染和提高猪肉出库时的微生物安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

四川某猪屠宰加工厂生产链中猪胴体表面、刀具及环境接触面的擦拭样品。

平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bole agar，VRBA）培养基 杭州微生物试剂有限公司；MRS、CFC选择培养基、假单胞菌CFC选择培养基添加剂、STAA培养基、STAA添加剂、煌绿乳糖胆盐（brilliant green lactose bile，BGLB）肉汤 青岛海博生物技术有限公司；Gengreen核酸染料、2×PCR MasterMix、DNA Marker DL15000 天根生化科技（北京）有限公司；细菌DNA提取试剂盒 美国Omega公司；琼脂糖 西班牙Biowest公司。

1.2 仪器与设备

PowerPac Basic型凝胶电泳仪、Gel Doc XR凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；JX-25B手提式高压灭菌锅宁波久兴医疗器械有限公司；DHG-9162电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司；ST 16R冷冻离心机 美国赛默飞公司。

1.3 方法

1.3.1 刀具和接触面取样

分别于生猪屠宰分割前期、中期和后期进行刀具和接触面取样。屠宰车间刀具包括刺杀放血、去头、开膛、劈半和修剪用刀具；分割车间接触面包括传送带、案板、肉框、刀具和操作人员手部。传送带、案板、肉框等接触面具体取样方法如下：采用100 cm取样器，随机选取3个点，共擦拭300 cm，剪下棉头放入含30 mL灭菌生理盐水的无菌采样袋中。刀具和操作人员手部采用25 cm取样器，随机选取4个点，共擦拭100 cm，剪下棉头装入含10 mL灭菌生理盐水的无菌采样袋中，作为原液于低温状态下送回实验室计数。将细菌原液以10 倍递增稀释成合适梯度进行微生物总数测定，每个稀释度做2个平行。重复取样3 次。

1.3.2 猪胴体表面取样

采用跟踪取样法，分别于刺杀放血（FX）、脱毛（TM）、开膛去脏（KT）、冲淋（CL）、冷却排酸（LQ）和分割（FG）后进行取样。除分割外，其余各环节随机选取3个猪胴体，每个胴体选取颈部、肩部、胸口部、背部和腿部5个部位，每个部位擦拭100 cm，共擦拭1 500 cm，然后剪下棉拭子放入装有150 mL无菌生理盐水的无菌采样袋中。分割后的采样包含前腿肉、后腿肉、里脊肉、肋排和五花肉5个部位，每个样品各部位随机选取3 块肉擦拭，擦拭方法与上述一致。将采集的样品原液分成两份，一份用于HTS，另一份梯度稀释后用于微生物计数。

1.3.3 微生物计数

菌落总数测定参考GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》；大肠菌群测定参考GB 4789.3—2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》第二法，大肠菌群的平板计数法；乳酸菌数测定参考GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》；假单胞菌数测定参考SN/T 4044—2014《出口肉及肉制品中假单胞菌属的计数方法》；热死环丝菌数测定参考傅鹏等的方法。计数所用选择性培养基和培养条件如表1所示。

表1 不同种类微生物的培养方法和条件Table 1 Cultivation methods and conditions for different groups of bacteria

1.3.4 HTS分析

1.3.4.1 DNA提取及PCR扩增

参考夏小龙的方法进行样品处理。取50 mL细菌原液2 000 r/min离心3 min，去除底部杂质，上清液于12 000 r/min离心10 min得菌体沉淀。收集的菌体沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤3 次，离心，然后将沉淀分装于3个2 mL无菌EP管中，-20 ℃保存。

采用细菌DNA提取试剂盒进行样品DNA提取，提取的DNA通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后委托上海美吉生物医药公司进行MiSeq平台测序分析。

1.3.4.2 测序数据处理及生物信息学分析

将测序得到的Raw Date经过Fastp（V0.19.6）和Flash（V1.2.11）进行质控、拼接和过滤，采用Uparse软件（V7.0.1090）按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类，得到OTU的代表序列以SILVA（Release138 http://www.arb-silva.de）数据库为基础，通过RDP Classifier（V 2.2，置信度阈值为0.7）进行分类学分析。通过Qiime平台（http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）进行多样性分析，包括Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数和覆盖率，并利用R语言工具绘制样品稀释曲线、群落柱形图和群落热图，统计不同样品在门和属水平上的组成差异。

1.4 数据处理

采用Excel 2016和Origin 2019b软件进行数据处理及绘图，采用SPSS 21.0软件进行差异显著性分析（＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 基于传统培养方法的微生物数量

2.1.1 刀具及各接触面污染的微生物情况

图1 屠宰分割车间刀具及接触面细菌菌落总数Fig. 1 Total number of bacterial colonies on the knives and contact surfaces in slaughter and segmentation workshops

由图1可知，屠宰车间各环节劈半刀具菌落总数较低（平均为4.49（lg（CFU/cm）），修剪刀具菌落总数较高（平均为5.21（lg（CFU/cm））），这可能是由于劈半刀具与猪胴体表面接触较少，且未与内脏接触，而修剪刀具主要修剪颈部淋巴等，颈部处于倒挂胴体的最下端从而导致污染严重。与屠宰前、后期相比，屠宰中期各环节刀具的污染均最为严重，且差异不显著（＞0.05），其次是屠宰后期。这是因为屠宰中期结束后会对刀具进行清水冲洗，说明定期清洗刀具能有效清除残留的血迹和组织，减少刀具表面的微生物附着。

分割车间各接触面的污染整体高于屠宰车间刀具，这与刘寿春等的研究结果一致。传送带和肉框的污染较严重，菌落总数平均值分别达6.34（lg（CFU/cm））和6.25（lg（CFU/cm）），这是因为潮湿的设备表面沾染了肉块碎屑和液体从而导致有氧菌大量增殖。其次是操作人员手部、案板和刀具，菌落总数平均值分别为6.08、5.94、5.93（lg（CFU/cm）），处于较高水平。NY/T 632—2002《冷却猪肉》规定冷却胴体应在良好操作规范和良好卫生条件下分割，刀具、箱框和工作人员手部应每隔1 h消毒1 次，可能与该企业未严格执行有关。同时，加工设备中的微生物也常在分割和低温贮藏的肉中发现，它们是导致肉类变质的主要因素，这说明加工环境及接触设备的洁净程度直接影响冷却猪肉的初始微生物水平。为最大限度地减少设备对屠体的微生物污染，监管机构要求屠宰场提供80 ℃以上热水以净化刀具和其他器皿，但部分企业并未严格执行；并且应该注意的是，热水浸泡时间的长短以及水中浮渣和沉淀量均对去污效果非常重要。已有研究表明，要消灭沙门氏菌需在82 ℃水中浸泡10～20 s。此外，许多肉类加工厂的传送带由铰链塑料段构成，常规清洁往往无法清除其中所有的肉屑，细菌不可避免地在其中生长，从而造成严重的交叉污染。

2.1.2 猪胴体表面污染微生物情况

图2 屠宰分割过程中猪胴体表面微生物污染情况Fig. 2 Microbial contamination on the surface of pig carcasses during slaughter and segmentation

由图2可知，不同屠宰阶段胴体表面的微生物数量存在差异，但整体变化趋势大致相同：脱毛、开膛、冲淋以及预冷后胴体表面的各类微生物数量逐渐减少，分割后有所上升，这与赵慧等的研究结果一致。Mann等的研究也得出类似结论，即细菌污染主要发生在猪屠宰的脱毛和胴体分割过程。2073/2005/EC《食品微生物标准》中规定猪胴体菌落总数的满意水平为4.0（lg（CFU/cm）），可接受水平为5.0（lg（CFU/cm）），基于此发现，本研究中菌落总数在开膛、冲淋和预冷后达到可接受水平，分别为4.83、4.21（lg（CFU/cm））和3.90（lg（CFU/cm））；但分割环节加重了胴体的污染，菌落总数达到5.76（lg（CFU/cm）），超出可接受水平，这是由于分割过程肉块与工人手部、刀具、传送带和肉框等接触，屠宰机械和分割设备表面的微生物对肉块造成了污染；还可能是因为分割车间温度（10～12 ℃）高于冷却排酸间温度（0～4 ℃）使得嗜冷微生物繁殖所致。此外，胴体表面的乳酸菌数量始终较高，平均数量为3.97（lg（CFU/cm）），其次是假单胞菌、大肠菌群和热死环丝菌，平均数量分别为2.42、2.18（lg（CFU/cm））和2.04（lg（CFU/cm））。

2.2 基于HTS分析猪胴体表面细菌菌群多样性

2.2.1 测序数据统计

对原始数据进行拼接、质控和过滤，最终得到881 458个有效序列，平均长度为427 bp，产生93～624个OTU。如图3所示，当样品测定序列数超过28 000时所有样品的稀释曲线均趋于平坦，说明已包含大部分多样性信息，测序深度足够。

图3 屠宰分割过程中猪胴体表面微生物的Sobs稀释曲线Fig. 3 Sobs rarefaction curves for the microbes on pig carcass surface during slaughter and segmentation

2.2.2多样性指数分析

如表2所示，放血和脱毛环节的Chao1、ACE和Shannon指数明显高于其他环节，屠宰分割过程中群落多样性依次为放血＞脱毛＞分割＞开膛＞冲淋＞冷却，冷却环节胴体表面的微生物多样性最低，分割后微生物多样性增加，说明分割环节是生猪屠宰过程中的关键污染环节，这与通过传统培养方法得到的结论一致。

表2 猪屠宰各环节样品的α多样性指数Table 2 α-Diversity index of samples from each stage of pig slaughter

2.2.3 不同分类学水平上物种组成分析

如图4所示，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）是屠宰分割过程中猪胴体表面丰度最高的3个门，平均相对丰度分别为83.53%、6.09%和5.96%。变形菌门相对丰度在冷却环节最高（98.67%），说明冷却环节细菌在门水平相对单一，分割后细菌门显著增加。放血和脱毛环节变形菌门的相对丰度差异不大，但脱毛环节门水平上的物种多样性较高，可能是因为脱毛过程中胴体表面的细菌杂质黏附到全胴体。

图4 猪胴体表面细菌门水平相对丰度变化Fig. 4 Changes in the relative abundance of bacterial phyla on the surface of pig carcass

由图5可知，屠宰分割过程中猪胴体表面相对丰度排名前5的菌属主要为不动杆菌属（）、气单胞菌属（）、金黄杆菌属（）、罗斯氏菌属（）和巨型球菌属（）。不动杆菌属和气单胞菌属是生猪肉中主要的优势菌属，这与大多数研究一致。虽然优势菌属基本相同，但相对丰度差异较大。不动杆菌属平均相对丰度为49.98%，冷却后不动杆菌属相对丰度最高，达到79.71%，其他菌属仅为2.94%，说明冷却过程能一定程度降低猪胴体表面菌群多样性。分割后不动杆菌属相对丰度仅为48.50%，其他各菌属相对丰度显著增加，说明分割是导致猪胴体微生物污染加剧的重要环节。气单胞菌属各环节的平均相对丰度为25.29%，但在放血环节只为1.96%，其他菌属相对丰度高达17.58%，说明猪胴体携带的原始微生物种类丰富。

图5 猪胴体表面细菌属水平相对丰度变化Fig. 5 Changes in the relative abundance of bacterial genera on the surface of pig carcass

2.2.4 屠宰分割过程中不同环节猪胴体表面细菌双聚类热图分析

根据属水平物种的注释结果，对分组样品丰度进行均值计算，选择总丰度排名前30的物种绘制屠宰分割过程中不同环节细菌的双聚类热图，其可以通过颜色变化与相似程度直观反映不同样品间群落组成的相似性和差异性。由图6可知，放血和脱毛环节丰度较高的菌属在开膛、冲淋、冷却和分割环节明显变少，从样本菌群结构的聚类树可以看出，开膛和冲淋环节猪胴体表面菌落结构相似度较高，与放血、脱毛、分割和冷却环节均存在较大差异。开膛和末端冲淋后菌群相似度较高，且与放血和脱毛后的菌群差异显著，说明开膛前的冲淋环节能够有效减少前期胴体表面的微生物附着，并在后续的开膛环节得到较好保持。冲淋、冷却和分割后的菌群组成存在差异是因为冷却能进一步减少胴体表面微生物，而分割会加大胴体表面的微生物污染。

图6 不同环节猪胴体表面属水平分布热图Fig. 6 Heatmap of genus-level distribution of bacterial community on pig carcass surface in different links

此外，传统培养方法检测到的优势菌属与测序结果存在差异。Dourou等发现，腐败菌研究中常规的培养基计数并不总是对应于HTS分析得出的微生物群落，特别是假单胞菌、不动杆菌、光细菌和弧菌科。这是由于发光菌具有耐冷性、营养挑剔，需要NaCl才能生长，通常（非）选择性培养基检测腐败菌会阻碍其生长，而HTS可检出培养基不能计数的细菌科和属（即不动杆菌和弧菌科（如发光菌））。同样地，Peruzy等通过16S rRNA扩增子测序对肉糜中微生物群落进行鉴定，并与传统分离方法进行比较，发现除肉中常见的优势菌群，这两种方法在同一样本中检测到的细菌种类不尽相同，这可能是因为大多数微生物不可培养或受培养温度和时间的限制，并且每种培养基都具有选择性。因此，传统培养只能一定程度反映微生物数量以及分离鉴定特定的微生物，将传统培养方法与HTS技术结合表征猪肉的复杂微生物区系十分必要。

3 结 论

基于传统培养方法和HTS技术相结合分析不同屠宰环节猪胴体表面的细菌菌相组成，传统培养方法与HTS得出的结论较为符合且相互补充，通过传统培养方法可以明确不同环节猪胴体表面各类微生物的污染情况，HTS则可以更深入解析猪胴体表面的细菌种属组成及相对丰度变化情况，因此，将传统培养方法与HTS技术相结合表征屠宰过程中猪胴体复杂的微生物环境非常必要。两种方法均表明脱毛和分割环节会加重胴体的微生物污染，脱毛环节的污染可以在后续冲淋和冷却环节中减轻，冷却后猪胴体表面的菌落总数达到可接受水平，但分割过程中造成的污染会直接影响猪肉出库时的微生物安全性，因此，分割环节为屠宰过程中的关键控制环节，对提高出库时猪肉的微生物安全性和控制分割过程的污染尤为重要。除严控分割车间的低温、对分割车间定期消毒、在操作台旁设置热水槽，提高工人勤洗手、刀具的意识外，还应在分割结束后彻底清洗设备并保持干燥，开发更安全高效的消毒剂以最大程度的抑制细菌生长。另外，本研究只针对屠宰过程猪胴体的细菌菌相组成进行分析，在潮湿的屠宰分割环境中真菌也容易污染猪肉导致腐败变质，因此屠宰过程中猪胴体表面的真菌污染情况和菌群结构也有必要进一步探索。