张超，邹贺康，翟明，庄远杯，丘波，吴家华，张声源，罗晓东*

1.嘉应学院 广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东 梅州 514015；2.嘉应学院 医学院 客家药用生物资源研究所，广东 梅州 514031；3.嘉应学院 医学院，广东 梅州 514031

金线吊乌龟Stephania cepharanthaHayata 为防己科千金藤属植物，又名头花千金藤、白药子，主产于广西、贵州、云南等地，《中华本草》记载其有清热解毒、凉血止血、消肿散结的功效，主治咽喉肿痛、热毒痈肿、风湿痹痛，在民间广泛用于治疗咽喉肿痛、风湿痹痛和腮腺炎等疾病[1-3]。现代药理学研究表明，千金藤属植物提取的生物碱千金藤素（cepharanthine，CEP）具有抗炎、清除自由基、抗肿瘤、抑制人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）和免疫调节等生物活性[4-5]。目前，国内外关于金线吊乌龟的研究主要集中于生物碱、黄酮、蒽醌、甾醇和糖类等化学成分和提取方法[6-8]，其药理学相关研究较少。

从民间应用和前人研究基础出发，为全面评价金线吊乌龟不同提取部位在抗炎、镇痛、抗氧化及抑制亚硝化的活性差异，本研究以金线吊乌龟的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物4 个不同极性部位为研究对象，采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法、醋酸扭体法和热板法评价抗炎、镇痛活性；采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法和2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）自由基清除法测定抗氧化活性；模拟人体胃酸条件（pH 3.0，温度37 ℃），采用盐酸萘乙二胺法和α-萘胺法测定抑制亚硝化活性，以期为金线吊乌龟的制剂开发和临床应用提供参考。

1 材料

1.1 药材

金线吊乌龟购于梅州市梅江区药材市场，经嘉应学院医学院客家药用生物资源研究所张声源副教授鉴定为防几科千金藤属多年生藤本植物金线吊乌龟Stephania cepharanthaHayata的块根。

1.2 动物

无特定病原体（SPF）级昆明种小鼠雄性60 只、雌性150 只，体质量（20±2）g，由南方医科大学实验动物管理中心提供，合格证号为44002100026062，实验动物使用许可证号为SCXK（粤）2021-0041。实验期间小鼠饲养于嘉应学院医学院实验动物房，温度20～26 ℃，相对湿度40%～70%，自由进食、饮水。

1.3 试药

双氯芬酸钠肠溶片（北京诺华制药有限公司，批号：X1283）；罗通定片（上海金不换兰考制药有限公司，批号：H41023917）；维生素C（VitC，西陇科学有限公司）；DPPH、ABTS（美国Sigma 公司，批号分别为STBB0829V、K1517067）；亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、二甲胺、1-萘胺、过硫酸钾、无水柠檬酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲苯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙酸（天津市大茂化学试剂厂）；无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）；0.9%氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.4 仪器

RB-200 型智能热板仪（成都泰盟软件有限公司）；Spark 型酶标仪（瑞士Tecan 公司）；UV-1800型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）。

2 方法

2.1 金线吊乌龟不同溶剂提取物的制备

金线吊乌龟2.0 kg 干燥后粉碎，用3 倍量95%乙醇加热回流提取3 次，每次30 min，合并提取液，减压浓缩得总浸膏225 g（得率11.25%）。取总浸膏200 g 分散于蒸馏水中，依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压回收溶剂，得石油醚提取物46 g（得率2.59%）、乙酸乙酯提取物12 g（得率0.67%）、正丁醇提取物59 g（得率3.32%）、水提取物83 g（得率4.67%）。

2.2 抗炎、镇痛活性考察

2.2.1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀法 SPF 级昆明种小鼠60 只，雌雄各半，随机分为6 组，每组10 只，分别为空白组（0.9%氯化钠溶液）、阳性组（双氯芬酸钠）及4个实验组（石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物）。阳性组小鼠按照0.01 g·kg-1灌胃双氯芬酸钠溶液，经前期开展的预实验毒性验证，4个实验组小鼠灌胃剂量为3 g·kg-1，空白组小鼠灌胃等体积0.9%氯化钠溶液。连续给药5 d，末次给药1 h 后，于小鼠右耳两面各涂二甲苯10 μL 激发炎症致肿。4 h 后颈椎脱臼处死，用打孔器沿右耳廓打一直径为5 mm的圆片，左耳相同部位打孔作对照，分析天平称质量记录，根据公式（1）、（2）计算各组肿胀度及肿胀抑制率。

2.2.2 醋酸扭体法 实验小鼠分组及给药同2.2.1项下方法。连续给药5 d，末次给药1 h后，按0.02 mL·g-1于小鼠腹腔注射0.6%乙酸溶液致痛，记录注射乙酸后20 min 内小鼠扭体反应（腹部和后肢因疼痛刺激而伸长）次数，并按公式（3）计算扭体反应抑制率。

2.2.3 热板法 将智能热板仪调至55 ℃，记录小鼠开始舔后足的时间，筛选5～30 s 舔后足的雌性昆明种SPF 级小鼠60 只，0.5 h 后再测定1 次，取两次舔后足的平均时间作为该小鼠的基础痛阈。分组同2.2.1 项下方法，阳性组小鼠按照0.1 g·kg-1灌胃罗通定溶液，其他组给药方式不变。连续给药5 d，末次给药后的第1、2 小时分别记录小鼠舔后足的时间作为给药后的痛阈，并根据公式（4）计算痛阈提高百分率。在热板上持续60 s 仍无舔足动作的小鼠痛阈按60 s记录。

2.3 抗氧化活性测定

2.3.1 DPPH 法 以适量无水乙醇充分溶解各实验组样品至0.40 mg·mL-1，溶解VitC至0.04 mg·mL-1，逐级稀释至0.5倍，共5个质量浓度，分别精密吸取不同质量浓度的样品溶液和VitC 溶液各80 μL 于96孔板中，各加入0.15 mmol·mL-1DPPH 无水乙醇溶液150 μL，混合后避光静置5 min，在酶标仪517 nm波长处测定各孔的吸光度（A），每个样品平行操作3 次，根据公式（5）计算各样品对DPPH 自由基的清除率。以质量浓度为横坐标（X）、清除率为纵坐标（Y）进行回归分析，计算半数抑制浓度（IC50），IC50越小，其活性越强。

式中Ai为样品反应体系的吸光度，Aj为对照反应体系的吸光度，A0为空白反应的吸光度。

2.3.2 ABTS法蒸馏水配制7.0 mmol·mL-1的ABTS 溶液与2.45 mmol·mL-1过硫酸钾溶液等体积混合后，室温避光静置12～16 h，制备ABTS母液。分别取10 mmol·L-1磷酸二氢钠溶液和磷酸氢二钠溶液19、81 mL，混匀，制备pH 7.4 的磷酸缓冲溶液。用pH 7.4 磷酸缓冲溶液调节ABTS 母液在734 nm 处A为0.70±0.02，即得ABTS 工作液。以无水乙醇充分溶解各组实验样品至质量浓度为0.16 mg·mL-1，逐级稀释至0.5倍，共5个质量浓度；无水乙醇充分溶解VitC 至质量浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg·mL-1。分别精密吸取不同质量浓度的样品溶液和VitC溶液各50 μL于96 孔板中，加入ABTS工作液200 μL，混合后避光静置5 min，在酶标仪734 nm处测定各孔的A，每个样品平行操作3次。根据公式（5）计算各样品对ABTS自由基的清除率和IC50。

2.4 抑制亚硝化活性测定

2.4.1 盐酸萘乙二胺法 分别取0.10 mol·L-1柠檬酸溶液198.63 mL 和0.20 mol·L-1磷酸氢二钠溶液51.37 mL，混匀，制备pH 3.0 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液。以无水乙醇充分溶解各组实验样品至质量浓度为20.00 mg·mL-1，逐级稀释至0.5倍，共5 个质量浓度；无水乙醇充分溶解VitC 至质量浓度分别为1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mg·mL-1。分别精密吸取不同质量浓度的样品溶液和VitC 溶液1.0 mL 于25 mL 具塞比色管中，依次加入pH 3.0 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2.0 mL，5 μg·mL-1亚硝酸钠溶液2.0 mL，充分混匀后37 ℃恒温反应1 h，加入0.4%对氨基苯磺酸2.0 mL，混匀，静置5 min后，加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液1.0 mL，定容至刻度，静置15 min后在紫外-可见分光光度计538 nm处测定A，每个样品平行操作3 次。根据公式（5）计算各样品对亚硝酸盐的清除率和IC50。

2.4.2α-萘胺法 以无水乙醇充分溶解样品各实验组样品溶液至质量浓度分别为4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg·mL-1，溶解VitC 至质量浓度分别为4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg·mL-1。分别精密吸取不同质量浓度的样品溶液和VitC 溶液1.0 mL 于25 mL具塞比色管中，依次加入pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液10.0 mL、1 mmoL·L-1亚硝酸钠溶液1.0 mL、1 mol·L-1的二甲胺溶液1.0 mL，定容至刻度，37 ℃恒温反应1 h。精密移取反应液1.0 mL 至培养皿，加入0.5%碳酸钠溶液0.5 mL，紫外灯（254 nm）下反应15 min 后依次加入1%对氨基苯磺酸1.5 mL、0.1%1-萘胺1.5 mL、蒸馏水0.5 mL，静置15 min后在紫外-可见分光光度计525 nm 处测定A，每个样品平行操作3 次。根据公式（6）计算各样品对亚硝胺合成的阻断率和IC50。

式中Ai为样品反应体系的吸光度，Aj为对照反应体系的吸光度，A0为空白反应的吸光度。

2.5 数据统计分析

采用SPSS 25.0 和Origin 8.5 软件对数据进行统计学分析，结果以（）表示。采用单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 金线吊乌龟不同提取物的抗炎、镇痛活性

3.1.1 小鼠耳廓肿胀度测定结果 各组小鼠耳廓肿胀度及肿胀抑制率见表1。与空白组比较，除乙酸乙酯提取物外，金线吊乌龟各提取部位均能显著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀（P＜0.05），其抑制能力大小依次为水提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物。其中水提取物对小鼠耳廓肿胀抑制率高达36.57%，具有较好的抗炎活性。

表1 金线吊乌龟不同提取部位对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响（, n=10）

表1 金线吊乌龟不同提取部位对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响（, n=10）

注：与空白组比较，*P＜0.05；表2～3同。

3.1.2 小鼠扭体次数测定结果 各组小鼠扭体次数测定结果见表2。与空白组比较，金线吊乌龟的水提取物和石油醚提取物均能显著抑制醋酸引起的小鼠扭体反应（P＜0.05），而乙酸乙酯和正丁醇作用不明显。其中，水提取物对小鼠扭体反应的抑制率较高，达到49.14%，优于其他3 个提取部位，显示出较好的外周镇痛作用。

表2 金线吊乌龟不同提取部位对醋酸致小鼠扭体反应的影响（, n=10）

表2 金线吊乌龟不同提取部位对醋酸致小鼠扭体反应的影响（, n=10）

3.1.3 小鼠痛阈测定结果 各组小鼠痛阈测定结果见表3。与空白组比较，金线吊乌龟各提取部位均能提高小鼠对热板的痛阈，在给药后1、2 h 都有不同程度的提高（P＜0.05）。其中，水提取物给药后1 h对小鼠痛阈的提高百分率为47.40%，2 h 提高百分率67.35%，且均优于其他3 个提取部位，显示出较好的中枢镇痛作用。

表3 金线吊乌龟不同提取部位对小鼠的痛阈提高率（, n=10）

表3 金线吊乌龟不同提取部位对小鼠的痛阈提高率（, n=10）

3.2 金线吊乌龟不同提取物的抗氧化活性

3.2.1 DPPH 自由基清除结果 各提取部位对DPPH 自由基的清除率测定结果及IC50见图1、表4。在实验质量浓度范围内，金线吊乌龟各提取部位对DPPH 自由基均有不同程度的清除作用，呈现量效关系，清除能力大小依次为乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物＞水提取物。当质量浓度为0.4 mg·mL-1时，乙酸乙酯提取物对DPPH自由基的清除率高达93.78%，且乙酸乙酯提取物清除作用的IC50值最低，为（0.084±0.008）mg·mL-1，表明乙酸乙酯提取物对DPPH自由基的清除能力最强，且与其他3个提取部位之间差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 金线吊乌龟不同提取部位对DPPH自由基的清除能力（, n=3）

3.2.2 ABTS 自由基清除结果 各提取部位对ABTS 自由基的清除率测定结果及IC50见图2、表4。在实验质量浓度范围内，金线吊乌龟各提取部位对ABTS 自由基均有不同程度的清除作用，呈一定的量效关系，清除能力大小依次为乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物＞水提取物。乙酸乙酯提取物清除作用的IC50最低，为（0.063±0.005）mg·mL-1，表明金线吊乌龟的乙酸乙酯提取物对ABTS 自由基的清除能力最强，与其他3 个提取部位之间差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 金线吊乌龟不同提取部位对ABTS自由基的清除能力（, n=3）

表4 金线吊乌龟不同提取部位抗氧化活性的IC50（, n=3）mg·mL-1

表4 金线吊乌龟不同提取部位抗氧化活性的IC50（, n=3）mg·mL-1

注：与水提取物比较，*P＜0.05；与石油醚提取物比较，#P＜0.05；与正丁醇提取物比较，△P＜0.05。

3.3 金线吊乌龟不同提取物的抑制亚硝化活性

3.3.1 亚硝酸盐清除结果 各提取部位对亚硝酸盐的清除率测定结果及IC50见图3、表5。在实验质量浓度范围内，金线吊乌龟各提取部位对亚硝酸盐均具有不同程度的清除作用，有较好的量效关系，清除能力大小依次为水提取物＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物。当水提取物质量浓度为20 mg·mL-1时对亚硝酸盐的清除率达到97.39%，且水提取物清除作用的IC50值最低（4.35±0.15）mg·mL-1，表明水提取物对亚硝酸盐的清除能力最强，与其他3个提取部位之间的差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 金线吊乌龟各提取部位对亚硝酸盐的清除能力（, n=3）

3.3.2 亚硝胺合成的阻断结果 各提取部位对亚硝胺合成的阻断率测定结果及IC50见表5、图4。在实验质量浓度范围内，金线吊乌龟各提取部位对亚硝胺的合成均有一定的阻断作用，阻断能力随质量浓度的增加而增强，阻断率大小依次为水提取物＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物。且水提取物阻断作用的IC50值最低，为（11.08±0.27）mg·mL-1，表明水提取物对亚硝胺合成的阻断能力最强，与其他3 个提取部位之间差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，随着质量浓度的升高，水提取物阻断亚硝胺的能力会优于同等质量浓度的阳性对照VitC。

图4 金线吊乌龟不同提取部位对亚硝胺合成的阻断能力（, n=3）

表5 金线吊乌龟各提取部位抑制亚硝化活性的IC50（, n=3）mg·mL-1

表5 金线吊乌龟各提取部位抑制亚硝化活性的IC50（, n=3）mg·mL-1

注：与石油醚提取物比较，*P＜0.05；与正丁醇提取物比较，#P＜0.05；与乙酸乙酯提取物比较，△P＜0.05。

4 结论与讨论

研究表明，人体内环境稳态被打破是导致各种癌症的危险因素，如炎症是诸多癌症的发病基础，自由基增多使活性氧的浓度增加，在癌症的发展中同样起促进作用。此外，长期摄入N-亚硝基化合物及自身代谢产生的内源性N-亚硝基化合物是食管癌、肝癌和鼻咽癌高发的重要因素。因此，癌症与炎症、自由基及N-亚硝基化合物这三者之间存在一定关联性[9-10]。目前，对于金线吊乌龟的研究多以化学成分研究为主，对其药效学报道较少，故本研究开展了基于抗炎、镇痛、抗氧化和抑制亚硝化3 种药效的金线吊乌龟不同提取部位的筛选研究，旨在对各提取部位进行精准、系统分析，从而明确各极性部位的药理活性，并为其药效物质的分离纯化提供实验基础。

疼痛作为生命的第五大体征，其产生的主要原因是组织损伤引起的炎症[11]。吲哚美辛、布洛芬和双氯芬酸钠等非甾体类药物，抗炎、镇痛的同时也存在影响血小板聚集和消化道损伤等严重不良反应，延缓患者康复且增加医护人员的负担[12-13]。因此，在天然药物中寻找和开发强效、低廉且不良反应少的新型抗炎镇痛药已成为新的研究趋势。本研究通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀反应制备急性炎症模型，考察药物抗炎活性；采用醋酸扭体法考察药物外周镇痛活性，热板法考察药物中枢镇痛活性。结果表明，金线吊乌龟4 个提取部位均有不同程度的抗炎、镇痛活性，其中水提取物的作用效果最显著，说明金线吊乌龟抗炎、镇痛活性物质富集于极性较大的水提取物，这可能与其富含多种生物碱类活性成分有关。文献报道多种生物碱类成分在相关疾病的抗炎、镇痛治疗中发挥较好的疗效[14]，如罗昱澜等[15]用千金藤属植物广西地不容中分离得到的总碱进行抗炎、镇痛评价，效果显著，因此有望从金线吊乌龟大极性部位甚至总生物碱中探索出新型、高效的抗炎镇痛药。

自由基化学性质活泼，在机体内部通过氧化反应使细胞膜和遗传物质产生应激性损伤，引起机体老化，进而增加各种退行性疾病的风险[16]，清除、抑制自由基已成为临床常见辅助治疗手段[17]。综合DPPH 法和ABTS 法2 种评价体系的测定结果，金线吊乌龟4 个提取部位均具有良好的抗氧化活性，且中等极性的乙酸乙酯提取物和较大极性的正丁醇提取物抗氧化活性较好，可能与这2 个部位富含黄酮等较大极性的化学成分有关。文献[18]报道植物总黄酮具有良好的抗氧化活性。此外，吴冬青等[19]发现，金线吊乌龟总黄酮清除DPPH 自由基活性显著且稳定性好，因此可针对金线吊乌龟的乙酸乙酯和正丁醇提取部位甚至总黄酮进行更深入的研究，进行抗氧化活性成分的靶向分离。

病因学分析表明，消化道癌症发病风险增加与N-亚硝基化合物的合成有直接关系[20]。亚硝酸盐作为N-亚硝基化合物的前体化合物，广泛存在于腌制食品中，摄入体内后在人体胃酸环境可与胺类发生亚硝胺反应，形成N-亚硝基化合物，进而引发一系列的肿瘤，甚至可以透过胎盘屏障诱导下一代患癌[21]。因此，清除体内亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成反应，是预防和控制相关癌症的有效途径。通过模拟人体胃内环境，综合评价金线吊乌龟的抑制亚硝化活性，结果表明，4 个提取部位均具有一定的抑制亚硝化活性，其中水提取物的抑制亚硝化活性最强，可能与水提取物富集极性较大的生物碱类活性物质有关，文献报道千金藤属植物块根、茎叶和种子中提取的多种生物碱，具有抗癌细胞生长和抗骨肉瘤等多种临床药理活性[4,22]，提示可以从金线吊乌龟水提取物中探索有助于癌症病因性预防的生物碱类成分。

综上所述，金线吊乌龟具有一定的抗炎、镇痛、抗氧化和抑制亚硝化活性，后续重点对其大、中极性提取部位开展系统的化学成分、构效关系及作用机制研究，将有助于阐明金线吊乌龟药用科学内涵，为这一药用资源的综合开发利用提供理论基础。