张岐 安斌芳 王立霞 郑雨桐 王佳 郭晓晴

摘 要：利用山梨酸钾与双氧水-硫酸溶液反应后形成丙二醛，丙二醛與硫代巴比妥酸生成红色化合物三甲川（3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮）的原理，以显色的深浅与山梨酸钾的含量在一定范围内成正比为基础，尝试开发乳酸菌制品山梨酸钾快速检测试剂盒。初步确定的试盒为塑料卡，试纸为硝酸纤维素膜;该试纸对标准山梨酸钾水溶液的检出限为1.0 g/L，对乳酸菌中山梨酸钾的低检出限也为1.0 g/L。该试剂盒具有体积小、便于携带、检测方便和成本低廉等特点，具有广泛的应用价值和市场开发前景。

关键词：山梨酸钾;试剂盒;乳酸菌;快速检测

Development of Test Paper Box for Rapid Detection of Potassium Sorbate

ZHANG Qi， AN Binfang， WANG Lixia*， ZHENG Yutong， WANG Jia， GUO Xiaoqing

（College of Medical Technology， Beihua University， Jilin 132013， China）

Abstract： The test based on the sorbic acid potassium react to the hydrogen peroxide oxidation， and form malondialdehyde， after that the malondialdehyde would combinate with glucosinolates barbituric acid （associates） and produce trimethine （3，5，5-trimethyloxazole trimethine （3，5，5-trimethyloxazole-2，4-dione） ，which is red compounds. Acording to the depth of the color  is proportional to the content of potassium sorbate within a certain range. The paper box for rapid detection of potassium sorbate of lactic acid  bacteria was developed. The preliminarily determined test box is plastic card and the test paper is nitrocellulose film. The detection limit of the paper for standard potassium sorbate aqueous solution is 1.0 g/L， and the detection limit of standard potassium sorbate solution in lactic acid bacteria is 1.0 g/L. The test paper box has the characteristics of small size， easy to carry， convenient detection and low cost， which has a wide range of application value and market development prospects.

Keywords： potassium sorbate; test kit; lactic acid bacteria; rapid detection

山梨酸钾，又名2，4-己二烯酸钾，是山梨酸的钾盐，分子式为C6H7O2K，白色至浅黄色鳞片状结晶、晶体颗粒或晶体粉末，无臭或微有臭味，长期暴露在空气中易吸潮、被氧化分解而变色，易溶于水，溶于丙二醇和乙醇[1-2]。其常被用作防腐剂，通过与微生物酶系统的巯基结合从而破坏许多酶系统，毒性远低于其他防腐剂。山梨酸钾含量一旦超标且长期被人们食用，会对人体产生伤害，在一定程度上抑制骨骼生长，以及损伤肝和肾[3]。因此，在食品卫生检验等方面，山梨酸钾含量的检测具有极其重要的意义[4]。本文研制了乳酸菌中山梨酸钾的检测试剂盒，并研究了其制作工艺、最低检测限、保存条件及时间等，该试剂盒具有快速检测、反应灵敏、携带方便及成本低廉等特点，具有广泛的应用价值和市场开发前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山梨酸钾、2-硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric Acid，TBA）、氢氧化钠（粒状）、盐酸、硫酸均为国产分析纯;30%双氧水;普通慢速定性滤纸、乙酸纤维素膜（Q/HSG 1-93）、硝酸纤维素膜（Startorius CN140）;PVC胶板（DB-8）、聚酯纤维素膜（MA0800）、玻璃纤维素膜（GL-b 01）、吸水垫（GRADE 270）、塑料卡（A-8）和衔接胶带：市售。“畅益星”乳酸菌风味饮料：市售。

1.2 仪器与设备

隔水式电热恒温培养箱（PYX-DHS-50X65-B-Ⅱ）;电子天平（沈阳龙腾有限公司）;往复式水浴恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）;3个250 mL烧杯;一个50 mL容量瓶;一个100 mL容量瓶;胶头滴管;玻璃棒;250 mL量筒;50 mL容量瓶;多个试管;3个空平板（15 cm）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验原理

利用山梨酸钾与双氧水-硫酸溶液氧化后形成丙二醛，然后丙二醛与硫代巴比妥酸（TBA）生成红色化合物三川甲，通过显色的深浅与山梨酸钾的含量在一定范围内成正比为理论基础，化学反应式如下：

C6H7KO2+H2O2+H2SO4→C3H4O2+H2O+K2SO4

C3H4O2+TBA→三甲川（紅色化合物）

1.3.2 山梨酸钾溶液的配制

称取干燥的山梨酸钾粉末0.250 g，加入蒸馏水50 mL，用50 mL容量瓶定容，配制出5.0 g/L的山梨酸钾标准液。然后将标准液稀释成6个等级的浓度梯度，配制成山梨酸钾应用液，浓度分别为5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L的山梨酸钾水溶液。

1.3.3 乳酸菌中山梨酸钾浓度梯度的配制

称取干燥的山梨酸钾粉末0.125 g、0.250 g、0.375 g、0.500 g和0.625 g分别加入6个5 mL乳酸菌饮料中，制备浓度分别为6.0 g/L、5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L和1.0 g/L的溶液。

1.3.4 显色剂浓度的确定

称取干燥的硫代巴比妥酸粉末4.00 g，用250 mL容量瓶定容，配制出16.0 g/L的硫代巴比妥酸标准液，然后用标准液稀释成4.0 g/L、8.0 g/L的硫代巴比妥酸溶液。不同浓度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L）的山梨酸钾溶液氧化之后分别加入4.0 g/L、8.0 g/L、16.0 g/L的硫代巴比妥酸溶液进行显色反应，确定显色反应的最佳显色剂浓度。

1.3.5 试纸条的制备及纸型筛选

选择普通慢速定性滤纸、乙酸纤维素膜、硝酸纤维素膜，将其裁剪成边长为8 cm正方形，用16.0 g/L硫代巴比妥酸中浸泡5～10 min，立即用镊子取出置于恒温箱（37 ℃）中干燥30 min，干燥结束后，观察经过硫代巴比妥酸浸泡的试纸条是否有变形和变色现象。若试纸条无变形和变色现象，将试纸的四边统一裁剪成3 cm×0.5 cm规格的长条，储存于避光、干燥、密闭处，备用。实验时，将试纸条整齐地放置于平板上。然后滴加经1% H2O2氧化后的不同浓度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L）的山梨酸钾溶液。观察试纸的显色情况，从显色速度、显色效果判断显色是否稳定。

1.3.6 灵敏度检测

用16 g/L的硫代巴比妥酸浸泡试纸条，然后分别与氧化之后的不同浓度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L）的山梨酸钾溶液进行显色实验，得出最低的显色浓度。

1.3.7 试纸条的保质期

将部分试纸条装入用黑色塑料袋密封的试管中，用橡胶塞塞紧放入冰箱（4 ℃），即模拟低温、避光、隔氧的保存环境。部分不进行任何处理，放置于抽屉中，即室温、普通避光、干燥环境。每隔2 d取出几片进行检测限和中等山梨酸钾浓度的显色实验。实验在上午或下午固定时间进行，尽量在相同光照强度下记录和拍照。

2 结果与分析

2.1 显色剂浓度的确定

随着山梨酸钾和TBA溶液浓度的增加，显色逐步加深。用16.0 g/L TBA溶液制作的试纸显色效果最好，具体见图1和表1。

在不同浓度TBA溶液试纸的显色结果

2.2 试纸条的制备及筛选

试纸条是影响实验结果的主要因素，其选择需要满足易吸附试剂且吸附量较大、干燥时间短、显色速度快和颜色变化明显等要求。本实验分别选用3种常见类型的试纸条，观察显色效果，确定最佳试纸条。经过实验发现，3种试纸条，普通定性滤纸吸药量少，显色效果差;乙酸纤维素膜虽吸药量较多，但显色结果一般。只有硝酸纤维素膜的吸药量大，吸药均匀，浸药干燥后形状没有变化，手感也无明显的改变，可确定为最佳纸型。显色结果表明，该类型试纸条显色均匀，显色速度快且颜色持续时间久，显色后纸的变形程度小，适合做成产品（表2）。因此，选择硝酸纤维素膜在乳酸菌中进行显色实验。

2.3 灵敏度检测结果

随着山梨酸钾浓度的增加，显色逐步加深。用16.0 g/L TBA溶液制作的试纸显色效果最好，本试纸条的检测范围大于1.0 g/L，最低检出限是1.0 g/L（图1）。

用试纸法分别检测乳酸菌中不同浓度梯度的山梨酸钾溶液，结果表明，当山梨酸钾溶液的浓度低于1.0 g/L时，肉眼无法辨别试纸的颜色变化。随着山梨酸钾浓度增加，试纸显色加深，当山梨酸钾溶液浓度达到3.0 g/L时，试纸显色为深棕色。因此，试纸的最低限度1.0 g/L（图2），此浓度等于乳酸菌中出现的山梨酸钾浓度（1.0 g/L）[5]。

2.4 试纸条的保质期

由表3可知，4 ℃避光保存条件下，40 d后部分试纸条开始发生颜色变化。室温避光条件下（18～27 ℃，抽屉中），30 d后试纸条变红。试纸条在低温和室温保存效果有明显差别，低温保存时间较长，效果较好，保存过程中注意避光。

以硝酸纤维素膜（NC膜）为显色区，玻璃纤维素膜为样品垫（滴加检测物：山梨酸钾），聚酯纤维素膜为显色剂垫（浸泡干燥后的TBA试纸），PVC胶板为底座，吸水垫为吸水滤纸加速样品的流动，见图3和图4。

3 结论

本实验建立了一种快速检测山梨酸钾浓度的试纸条法，对其制备工艺条件及配方进行了优化，结果表明，采用硝酸纤维素膜、质量浓度为16.0 g/L的TBA溶液、浸泡时间5～10 min、干燥温度37 ℃，制备的试纸具有良好的性能。试纸法检测山梨酸钾仅需5～10 min，检测灵敏度为1 g/L，具有样品量小、反应灵敏、成本低廉、使用方便和操作简单的优点。与传统的山梨酸钾实验检测方法相比，实现了现场快速检测，其检测范围较大，应用领域广泛，是一种快速半定量检测方法，在食品、发酵、医学和药学等产业中有良好的发展前景。

参考文献

[1]张清航，张永涛.植物体内丙二醛（MDA）含量对干旱的响应[J].林业勘查设计，2019（1）：110-112.

[2]罗瑞山，晏会英.山梨酸钾在调味食品中生产的应用[J].中国调味品，1993（2）：22-23.

[3]王亚飞，王志力.新型食品防腐剂山梨酸的合成[J].黑龙江八一农垦大学学报，2006，18（1）：67-69.

[4]李汝珍.食品防腐用山梨酸的制备与应用[J].广西化工，2000，29（2）：27-29.

[5]桑宏庆，王丽，汪伟.辛硫磷试纸的制备及其在金银花检测中的应用[J].分析试验室，2014，33（7）：778-781.