雷志恒 王壮壮 龚 伟 刘彦廷

(三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 神经外科， 湖北 宜昌 443003)

脑胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤，恶性程度较高，多呈侵袭式生长，综合治疗后极易复发。既往研究发现，转化生长因子β受体1(transforming growth factor beta type I receptor, TGFBR1)在胶质瘤细胞的迁移和侵袭中发挥重要调控作用[1]。Huynh等[2]提出，抑制TGFBR1活性可降低胶质瘤侵袭能力。然而，TGFBR1拮抗剂如曲尼司特或SD-208缺乏敏感性及靶向性[2]，临床应用受限。因此，寻找新的调控因子对脑胶质瘤治疗具有重要临床意义。

前期研究发现，胶质瘤细胞染色体9q22.33出现局部缺失或突变的几率约为18%，而lncRNA NAMA(long non-protein coding RNA，associated with MAP kinase pathway and growth arrest，NAMA)与该位点高度重合，且位于TGFBR1上游[3]。替莫唑胺(temozolomide, TMZ)耐药胶质瘤细胞中lncRNA NAMA表达量高于TMZ敏感细胞[4]。Zheng等[5]在甲状腺乳头状癌细胞研究中发现，lncRNA NAMA对细胞增殖、凋亡、DNA损伤、细胞周期、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路等发挥调控作用。鉴于多数lncRNAs可作为顺/反式作用元件调控临近基因转录，本研究拟探讨lncRNA NAMA对胶质瘤细胞侵袭能力的影响，并探索其作用机制，以期为胶质瘤治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 胶质瘤组织及细胞

本研究选取2018年6月～2020年1月在我院接受手术治疗的胶质瘤患者组织样本共30例，经患者知情同意(伦理批准编号：HEC-KYJJ2018-006-01)。纳入标准：参考世界卫生组织(World Health Organization, WHO)胶质瘤诊断及分级标准，术后病理诊断为胶质瘤。入选患者术前未接受抗肿瘤治疗。胶质瘤细胞U87购自南方医科大学基础医学院实验室。

1.2 主要试剂及设备

RT-PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司，CCK-8试剂盒购于美国Sigma公司，TGFBR1和β-actin抗体均购于Abcam公司，transwell试剂盒购自武汉赛维尔科技有限公司，lncRNA NAMA过表达质粒(plasmid complementory DNA-NAMA，pcDNA-NAMA)及对照(pcDNA vacancy control，pcDNA-VC)、lncRNA NAMA干扰质粒(small interference-NAMA，si-NAMA)及对照(si-negative control, si-NC)、TGFBR1干扰质粒(small interference-TGFBR1，si-TGFBR1)及对照(si-NC)由上海康成生物公司合成，胎牛血清购自美国Gibco公司，RPMI 1640购自广州益龙科技有限公司，Lipofectamine 2000及TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司。

1.3 胶质瘤细胞U87培养及质粒转染

U87细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中常规培养，添加链霉素100 μg/mL及青链霉100 μg/mL，设定培养箱参数：恒温37℃、95%饱和湿度，5% CO2培养箱，视细胞生长状态2～3天更换培养基。使用Lipofectamine 2000转染细胞至融合，Opti-MEM稀释pcDNA或siRNA，静置待RNA/DNA-Lipofectamine 2000混合，15 min后加入细胞培养基常规培养。

1.4 实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)

采用TRIzol试剂提取细胞或组织总RNA，按照RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA。采用ABI Prism 7500型荧光定量PCR仪进行扩增，选择内参GAPDH进行标准化，采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

NAMA上游引物序列：5’-ATCCGCCCGTTACTAAACG-3’；下游引物序列：5’-CCGTCTAG-AGCAGGCCCACCTA-3’。

TGFBR1上游引物序列：5’-ATGTGCCTGCACGGCCATAG-3’；下游引物序列：5’-ACCGGTATCGTTCCGTTGATGC-3’。

GAPDH上游引物序列：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’；下游引物序列：5’-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3’。

1.5 Transwell检测细胞侵袭

在24孔板中插入带基质胶预涂层的transwell腔体，取200 μL细胞悬液接种于包被基质胶的上室，调整细胞浓度为2×104个/mL，下室含完全培养基，常规培养24 h后，取出腔室，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色20 min。每个样品随机选取6个视野，统计穿透细胞数量。

1.6 Western blot检测TGFBR1蛋白表达

取对数生长期细胞，提取总蛋白后行10%SDS-PAGE凝胶电泳分离目标蛋白。将目标蛋白转膜后，封闭2 h，4℃下加入TGFBR1(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)抗体4℃孵育24 h，洗膜3次后滴加二抗(1∶2 000)，室温下孵育1.5～2 h。滴加化学发光试剂(ECL)反应2 min，使用ChemiDocMP显影。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA NAMA在胶质瘤组织中的表达情况

UCSC数据库显示：lncRNA NAMA位于第9号染色体，NC_000009.12(99355340..99375257)，TGFBR1基因下游，基因全长1 681 nt，相关外显子10个。在30例胶质瘤组织中，lncRNA NAMA表达量与患者年龄、性别无相关性(均P>0.05)，与胶质瘤病理分级存在正相关性(P>0.05，见表1)。

表1 lncRNA NAMA表达量与胶质瘤患者临床特征关系

RT-PCR结果显示：lncRNA NAMA在肿瘤组织中表达量高于瘤旁组织(t=4.59，P<0.01)，详见图1。

注：胶质瘤组织与瘤旁组织比较，*P<0.01图1 RT-PCR检测lncRNA NAMA在不同组织中的表达量

2.2 lncRNA NAMA对U87细胞侵袭能力的影响

lncRNA NAMA过表达质粒(pcDNA-NAMA)或干扰质粒(si-NAMA)转染U87细胞后，RT-PCR检测结果显示，pcDNA-NAMA组NAMA含量高于pcDNA-VC组(t=5.31,P<0.01)(图2A)；si-NAMA组NAMA含量低于si-NC组(t=4.36,P<0.01)(图2B)。Transwell结果显示，pcDNA-NAMA组视野内透过细胞数多于pcDNA-VC组(226±27.30 vs 156±18.41，t=3.68，P<0.01)，si-NAMA组视野内透过细胞数少于si-NC组(84±9.63 vs 142±15.22，t=3.72,P<0.01)，差异均具有统计学意义(图2C)。

注：A、B：lncRNA NAMA的相对表达量，与对照组相比，*P<0.01；C：Transwell法检测细胞穿透数量，结晶紫染色(×200)图2 lncRNA NAMA对U87细胞侵袭能力的影响

2.3 lncRNA NAMA对TGFBR1表达的影响

RT-PCR及Western blot结果显示，pcDNA-NAMA组细胞TGFBR1的mRNA及蛋白含量均高于pcDNA-VC组(图3A、3C)(均P<0.01)；si-NAMA组细胞TGFBR1的mRNA及蛋白含量均低于si-NC组(图3B、3C)(均P<0.01)。

注：A、B：RT-PCR检测lncRNA NAMA的相对表达量，与对照组相比，*P<0.01；C：Western blotting检测各组细胞TGFBR1蛋白表达情况图3 lncRNA NAMA对TGFBR1表达的影响

2.4 下调TGFBR1对lncRNA NAMA调控U87细胞侵袭的影响

为验证lncRNA NAMA调节U87细胞侵袭是否依赖TGFBR1，将si-TGFBR1与pcDNA-NAMA质粒共转染U87细胞。Transwell检测结果显示，si-TGFBR1+pcDNA-VC组与si-TGFBR1+pcDNA-NAMA组相比，视野内透过细胞数差异无统计学意义(77±9.34 vs 86±8.52，t=0.43,P>0.05，见图4)。

注：Transwell法检测细胞穿透数量，结晶紫染色(×200)图4 下调TGFBR1对lncRNA NAMA调控U87细胞侵袭的影响

3 讨论

Cunha等[6]通过蛋白质谱分析胶质瘤患者的病理组织，发现侵袭相关蛋白含量较高的患者群体复发率更高，生存周期更短，更易出现化疗耐药。在胶质瘤细胞迁移和侵袭的机制研究中，TGFBR1发挥重要调控作用。如Zhang等[7]研究显示，通过抑制TGFBR1活性，可提高胶质瘤患者放化疗敏感性，并延长胶质母细胞瘤患者生存周期。Liu等[8]在胶质瘤细胞系中敲除TGFBR1后，发现细胞增殖活性明显降低。然而，由于TGFBR1的反义寡核苷酸或蛋白酶抑制剂缺乏靶向性及特异性，这限制了TGFBR1在胶质瘤生物治疗中的进展。因此，探索新的调控因子具有重要的临床指导意义。

近期研究发现，胶质瘤组织和细胞系中存在异常表达的lncRNAs，对胶质瘤的侵袭能力发挥重要调控作用。Li等[9]发现，lncRNA-ZNF281通过影响胶质瘤干细胞活性，调控胶质瘤细胞U251的增殖与侵袭。Dai等[10]发现，lncRNA AWPPH 通过激活TGF-β信号通路，促进胶质瘤细胞侵袭与迁移。本研究结果显示，lncRNA NAMA在不同病理级别胶质瘤组织中，存在差异性表达。在Ⅲ+Ⅳ级胶质瘤组织中，表达量高于Ⅰ+Ⅱ级。此外，过表达lncRNA NAMA后，细胞侵袭能力增强，抑制其表达后，细胞侵袭能力降低，提示lncRNA NAMA参与调控U87细胞的侵袭。

目前关于lncRNA NAMA的研究主要集中在细胞增殖、凋亡、DNA损伤、细胞周期及MAPK信号通路等方面[11]。Zheng等[5]通过小干扰RNA(siRNA)技术敲除甲状腺癌K1细胞中的NAMA后，细胞凋亡比例增高，细胞生长停滞。MEK抑制剂或依托泊苷处理NPA87细胞后，细胞内ERK磷酸化水平降低，细胞生长速度减慢。本研究通过对lncRNA NAMA和TGFBR1染色质位点分析发现，lncRNA NAMA与TGFBR1均位于第9号染色体，lncRNA NAMA基因全长1 681 nt，位于TGFBR1基因下游。在U87细胞中，lncRNA NAMA过表达或抑制后，TGFBR1 mRNA和蛋白质水平均相应升高或者降低，提示lncRNA NAMA可能是TGFBR1的调控因子之一。

LncRNA对编码基因的调控方式较多，包括lncRNA转录后调控，蛋白质修饰与锚定及编码功能性微肽等。在mRNA选择性剪接过程中，Booy等[12]发现，lncRNA BC200通过剪接因子hnRNP A2/B1，与Bcl-x前体mRNA形成复合体，参与调控乳腺癌细胞的迁移。此外，lncRNAs可形成保护性“lncRNA-mRNA”双链结构，增强mRNAs稳定性。Sheng等[13]在胶质瘤组织中发现，lncRNA ST7-AS1可靶向结合PTBP1 mRNA前体，抑制其降解。除调控mRNA选择性剪接及稳定性外，竞争性结合内源性RNA(ceRNAs)或miRNA海绵机制同样参与lncRNAs转录后调控[14]。Zheng等[15]在高级别胶质瘤母细胞瘤患者中证实，lncRNA CRNDE竞争性结合miR-384，降低miR-384对其下游靶基因STAT3、cyclin D1和Bcl-2的抑制作用。本研究发现，在U87细胞中干扰或过表达NAMA后，TGFBR1 mRNA及蛋白含量均相应降低或升高。基于lncRNA NAMA与TGFBR1染色质位置临近，推测其可能通过与TGFBR1 RNA结合，或增强TGFBR1转录等方式发挥作用。同时，不排除lncRNA作为宿主RNA，通过形成siRNA或miRNA片段发挥作用，课题组后期将深入对比NAMA保守区域序列与TGFBR1关联miRNA序列，进一步探索NAMA对TGFBR1的调控机制。

本研究不足之处在于未将lncRNA NAMA与TGFBR1激动剂或抑制剂进行对比，且所选细胞系较为单一，并未在动物实验中加以论证，后期我们将进一步探索，以期为胶质瘤治疗提供新的实验依据。