刘英敏，陈 飞，年 薇，范志勤

（新疆医科大学附属肿瘤医院日间手术病房，乌鲁木齐 830011）

食管癌是常见的上消化系统恶性肿瘤，我国食管癌的发病率为32.4/10 万，其中90%以上为食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）[1]，食管鳞癌的发病率高、侵袭性强、诊治手段有限导致患者预后不良，5 年生存率约为15%～20%[2]。正常细胞的恶性转化伴随着细胞外基质的改变，细胞外基质的重塑可增强肿瘤细胞迁移、侵袭能力。相关研究表明赖氨酰氧化酶样蛋白2（Lysyl oxidase like 2，LOXL2）作为铜依赖性氨基氧化酶家族成员之一，可通过催化细胞外基质中胶原蛋白的赖氨酸残基分子交联，重塑细胞外基质，参与肿瘤细胞的恶性生物学行为转化过程[3]。I 型胶原蛋白α1 链(Collagen type I alpha 1，COL1A1)是原癌基因，在多种恶性肿瘤中高表达，促进肿瘤的浸润与转移[4]。Wei 等[5]研究发现LOXL2 在结肠恶性肿瘤呈高表达，可通过促进胶原蛋白交联和细胞外基质硬化，使肿瘤侵袭、转移能力增强。但LOXL2 和COL1A1 在食管鳞癌中的表达及作用尚不完全明确。本研究采用qRT-PCR 检测LOXL2和COL1A1在食管鳞癌中的表达水平，分析两者表达相关性及其与患者临床病理特征的关系，初步探索两者在食管鳞癌患者病情进展中的作用，为食管鳞癌患者的临床诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料以2019 年9 月-12 月新疆医科大学附属肿瘤医院收治的45 例食管鳞癌患者为研究组，其中男性28例，女性17例，年龄45～71岁，中位年龄59岁。肿瘤直径<5 cm 者33 例，肿瘤直径≥5 cm 者12例；肿瘤组织高分化10 例，中分化23 例，低分化12例；有脉管瘤栓15 例，无脉管瘤栓30 例；淋巴结转移患者32 例，无淋巴结转移患者13 例。肿瘤临床分期：I 期5 例，Ⅱ期17 例，Ⅲ期23 例。选取同期3 例健康体检者作为对照组，其中男性2 例，女性1 例，年龄58～75 岁，中位年龄67 岁。本研究通过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准（伦理编号：K-2019053），患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准[6]纳入标准：（1）首次确诊食管鳞癌患者，获取血标本及组织标本前未行化疗、放疗等辅助治疗；（2）术后标本经病理证实为食管鳞癌；（3）术后标本切缘距癌组织>5 cm。排除标准：（1）转移性食管鳞癌；（2）合并其他恶性肿瘤；（3）临床资料和病理资料不完整。

1.3 样本采集方法收集45 例食管鳞癌患者术后的新鲜肿瘤组织标本及对应癌旁组织标本（距癌组织边缘>5 cm处的组织），所有组织标本术中离体30 min内就地取材，生理盐水清洗后液氮速冻，置于-80℃冰箱中保存待检。收集9 例食管鳞癌患者和3 例健康体检者静脉血8 mL，4°C 下，1 500 r/min 离心10 min，收集4 mL血浆，置于-80℃冰箱中保存待检。

1.4 LOXL2和COL1A1的表达水平测定

1.4.1 LOXL2 mRNA 和COL1A1 mRNA 的测定 将食管鳞癌及癌旁组织标本分别放入液氮预冷的研钵中，在液氮包围的状态下研磨成粉，按照Trizol 试剂盒说明书操作提取组织RNA，用核酸蛋白定量仪检测RNA 浓度和OD260/280 的比值，琼脂糖电泳检测RNA 完整性。经检测在电泳图中，以28S 与18S 亮度较高，5S 最弱或无条带，条带单一、完整且RNA 的OD260/280 的比值在1.8～2.0 之间视为合格RNA 样本。所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0 软件设计、合成，以管家基因GAPDH 为内参，引物序列见表1。所有样本的反应体系均为20 μL:Ran⁃dom Primer(0.1 mg/mL) 1 mL，2×TS Reaction Mix 10 mL，TransScript@RT/RI Enzyme Mix 1 mL，gDNA Re⁃mover 1 mL，用双蒸馏水补足体系。反应参数：预变性95℃2 min；变性95℃5 s；退火/延伸60℃30 s；进行40个循环。每次反应均均设空白对照和标准阳性对照。采用2-△△Ct 方法计算mRNA 相对表达水平。以计算出的相对表达水平均值为界值，将食管鳞癌患者分为LOXL2和COL1A1高表达组和低表达组。

表1 扩增引物序列

1.4.2 血浆外泌体LOXL2 蛋白的测定按照外泌体提取试剂盒（凯杰试剂有限公司）说明书操作提取血浆外泌体，在4 mL 血浆中加入1 倍体积的XBP，颠倒混匀5 次。将混合物加入到exoEasy 自旋柱离心管中，500 r/min 离心3 min。加入10 mLXWP 后，2 800 r/min离心7 min，清除残留缓冲液。将旋转柱转移到一个新的收集管上，加入400 μL 缓冲XE 到膜上，孵育3 min，500 r/min离心5 min收集洗脱液。将洗脱液回柱重新加入外易旋转柱膜，孵育3 min，2 800 r/min 离心8 min 收集洗脱液。将分离获得的外泌体使用1 mL PBS 重悬，密封置于冰上。选择一次性干净的样品池，用无尘纸擦拭确保光路上无颗粒附着外管壁。缓慢注入外泌体溶液，避免产生气泡，可适度倾斜样品池，用盖子封住样品池。采用Western Blot 试剂盒测定外泌体表面蛋白标志物ALIX 和CD63，提取总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白含量。采用SDS-PAGE凝胶电泳法分离总蛋白，将总蛋白转至PVDF 膜，PVDF 膜经封闭后加入相应的ALIX (1:1 000，ab186429;美国abcam) 、CD63 (1:1 000，ab134045;ab⁃cam)一抗孵育过夜，PBST 缓冲液洗膜后再加入二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1:5 000,ab205718;Abcam)孵育，经显色液进行化学发光，通过红外荧光扫描成像检测蛋白表达。

1.5 统计学处理采用SPSS 24.0 统计学软件对数据进行统计分析，GraphPad Prism 8.0 辅助作图。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，计数资料以例（%）表示，采用χ2检验，相关性分析采用Pearson 相关性检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LOXL2mRNA 和COL1A1mRNA 在食管鳞癌及癌旁组织中的表达水平食管鳞癌组织中LOXL2 mRNA 的相对表达水平（1.719±0.521）高于癌旁组织（1.078±0.305），差异有统计学意义(t=7.116，P<0.05)。食管鳞癌组织中COL1A1 mRNA 的相对表达水平（1.476±0.379）高于癌旁组织（1.045±0.306），差异有统计学意义（t=5.935，P<0.05），见图1。

图1 LOXL2mRNA和COL1A1mRNA在食管鳞癌组织和癌旁组织中的相对表达水平

2.2 LOXL2mRNA 和COL1A1mRNA 表达与临床病理特征的关系食管管鳞癌组织中LOXL2mRNA高表达与肿瘤分化程度（χ2=8.879，P=0.012）、淋巴结转移（χ2=4.549，P=0.033）、TNM 分期（χ2=7.123，P=0.028）相关，LOXL2mRNA 表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、脉管癌栓无相关性。COL1A1mRNA 高表达与低表达比较在区域淋巴结转移（χ2=4.874，P=0.047）、TNM 分期（χ2=8.186，P=0.017）上差异有统计学意义；患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度、脉管癌栓等临床特征比较差异无统计学意义，见表2。

表2 LOXL2mRNA和COL1A1mRNA表达与临床病理特征的关系

2.3 LOXL2mRNA 和COL1A1mRNA 在食管鳞癌组织中的相关性分析Pearson 相关性分析结果显示，食管鳞癌组织中LOXL2mRNA 和COL1A1mRNA 表达呈正相关（r=0.728 9，P<0.05），见图2。

图2 食管鳞癌组织中LOXL2mRNA和COL1A1mRNA表达的相关性

2.4 血浆外泌体LOXL2 蛋白在食管鳞癌组和健康对照组中的表达水平血浆外泌体提取物呈典型的椭圆形囊泡，包膜完整，未见细胞碎片，Western Blot 检测外泌体特异的蛋白标志物ALIX 和CD63，结果显示血浆外泌体中可见明显的蛋白标志物表达条带，见图3。Nanosight 检测正常健康体检者血浆外泌体浓度均值为1.25×109个/mL，直径峰值为213.8 nm；食管鳞癌患者血浆外泌体浓度均值为1.86×109个/mL，直径峰值为242.3 nm，见图4。食管鳞癌组的血浆外泌体LOXL2 蛋白表达水平（0.490±0.097）高于健康对照组血浆外泌体LOXL2 蛋白表达水平（0.310±0.052），差异有统计学意义(t=3.005，P<0.05)。

图3 WesternBlot鉴定血浆外泌体标志分子蛋白表达图

图4 NanoSight血浆外泌体粒径分布图

3 讨论

新疆是食管鳞癌的高发地区，食管鳞癌早期症状轻微，多数患者就诊时已存在局部浸润或/和远处转移，导致预后不良[7]，因此研究食管鳞癌侵袭、转移的机制，延长患者生存时间、提高患者生存质量有重要临床意义。细胞外基质是癌细胞发生发展的微环境，重塑细胞外基质促使肿瘤细胞恶性生物学行为改变[8]。

LOXL2 是由774 个氨基酸组成的87 kDa 的酶蛋白，可诱导细胞外基质胶原和弹性蛋白的交联，重塑细胞外基质，使肿瘤更易发生局部浸润及远处转移[9]。本研究结果显示LOXL2 在食管鳞癌组织中表达水平显著高于癌旁组织，同时肿瘤组织分化程度低、存在区域淋巴结转移、TNM 分期较晚的食管鳞癌患者中LOXL2 的表达水平相对增高，提示LOXL2 可能参与食管鳞癌的发生过程，这与陈阳静等[10]报道结果一致。Ninomiya 等[11]研究发现LOXL2 在肝恶性肿瘤中的表达异常表达，并可通过激活Snail 信号通路诱导EMT，增强肝癌细胞的浸润、侵袭能力，促进肝癌转移。据以上研究结果推测LOXL2 在食管鳞癌的发生发展中发挥重要促进作用，能成为判断食管鳞癌浸润、转移的有效生物标志物。

I 型胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，由两条COL1A1 和一条COL1A2 构成，在一定程度上决定着细胞外基质的最终结构和完整性，为肿瘤细胞的生长提供依附和支架，在多种肿瘤的发生和浸润转移中发挥着重要的作用[12-13]。Chen 等[14]通过分析胃癌患者组织中胶原蛋白家族的差异性，发现COL1A1 在胃癌组织中表达水平显著高于癌旁组织，高表达的患者死亡率是低表达者2.33 倍，是胃癌预后不良的因素。Chao 等[15]研究发现COL1A1 过表达可激活TGF-β 信号通路促进人乳腺癌细胞株的增殖、迁移及侵袭。本研究结果显示，COL1A1 在食管鳞癌组织中的表达水平明显升高，其异常高表达与患者局部淋巴结转移、肿瘤分期晚密切相关；COL1A1 高表达在食管鳞癌中发挥促癌作用，参与食管鳞癌的病情进展过程。

本研究通过Pearson相关性分析发现在食管鳞癌组织中LOXL2 和COL1A1 的表达水平呈正相关。Yu等[16]研究与本研究结果一致，发现LOX在口腔鳞癌中高表达并上调胶原含量，证实LOX 可调控胶原蛋白的表达。Dinca等[17]从细胞生物学方面解释了LOXL2调控胶原蛋白I的表达及排列方式，LOXL2促进细胞外基质中胶原蛋白I 纤维交联重组和排列导致定向的肿瘤细胞运动，从而促进肿瘤转移。

为进一步探索LOXL2 与COL1A1 在食管鳞癌中的调控机制，本研究检测食管鳞癌患者血浆外泌体中LOXL2 的含量。外泌体是由细胞分泌到细胞外间隙的40～150 nm 的囊泡样结构，可从亲本细胞中富集DNA、RNA 和蛋白质[18]，为细胞间交互、细胞与细胞外基质间的信号传递发挥重要功能。本研究发现食管鳞癌患者的血浆外泌体体积明显增大，富含的LOXL2 蛋白量明显高于健康对照组。Zhu 等[19]在头颈部恶性肿瘤的研究中同样发现相较于健康组，恶性肿瘤患者的外泌体LOXL2 蛋白表达量明显增多，并与不良预后相关。Olivier 等[20]研究发现恶性肿瘤分泌的外泌体可介导LOXL2 催化细胞外基质中胶原的交联，促进肿瘤细胞侵袭、迁移能力。据以上研究结果推测食管鳞癌中LOXL2 和COL1A1 通过外泌体这一介质发挥协同调控作用。

综上所述，LOXL2mRNA 和COL1A1mRNA 在食管鳞癌组织中表达水平增高，两者高表达与肿瘤TNM 分期、区域淋巴结转移密切相关，同时两者表达呈正相关，LOXL2和COL1A1可能通过外泌体协同调控食管鳞癌的侵袭、转移。本研究仍有不足，目前未证实食管鳞癌中LOXL2 通过外泌体上调COL1A1 的表达重塑细胞外基质的直接关系，有待后续细胞实验深入探讨明确LOXL2 对COL1A1 调控作用的具体机制。