叶子扬, 张鑫淼, 叶红玲, 叶 明

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 2.安庆职业技术学院 农林与服装学院,安徽 安庆 246003)

0 引言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤,也是与癌症相关死亡的三大主要原因之一,每年约有60万人死亡[1-3],一些药物治疗和肝移植会引起不良反应,因此治疗肝癌的方法有限[4-5]。本课题组前期的研究表明粒毛盘菌(Lachnumsp.)多糖具有较强的抗肿瘤活性。文献[6]证实磷酸酯化和硫酸酯化修饰显著增强了粒毛盘菌多糖对小鼠CT26结肠癌细胞、小鼠Lewis肺癌细胞和人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用。文献[7]发现粒毛盘菌多糖通过增强抗肿瘤免疫反应并使肿瘤相关巨噬细胞诱导成M1表型抑制S180肉瘤。近年来,研究者发现多糖-纳米粒子具有良好的生物相容性、无毒且成本低,因此受到许多学者的关注[3]。但是,关于粒毛盘菌多糖在纳米领域的应用并不多。

硒(Se)是一种重要的微量元素,具有抗氧化、抗肿瘤及其他生物活性,与免疫调节和人类健康密切相关[8],然而由于有效剂量和毒性剂量之间的微小差异,其生物利用度非常有限[9]。零价红色硒纳米粒子(SE0NPs)由于其多价氧化还原能力和不同形式硒的生物安全性而具有独特的特性[10-11]。因为纳米硒在氧化还原及清除自由基的能力方面具有尺度效应,其粒径越小,抗氧化能力越强,所以需要在纳米硒表面加以修饰,以阻止纳米粒子的聚集[12]。

本研究选用粒毛盘菌YM405胞外多糖LEP-2b和Na2SeO3为原料,采用抗坏血酸还原法制备LEP2b-SeNPs,并研究其抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

粒毛盘菌YM405菌株的子实体采自中国云南省,由合肥工业大学微生物资源与应用研究室分离并保藏。

1.2 实验方法

1.2.1 粒毛盘菌YM405胞外多糖的分离纯化

参照文献[13]的方法并稍作修改,配制发酵培养基。接种粒毛盘菌YM405后,以100 r/min速度搅拌、30 ℃恒温发酵6 d。抽滤、浓缩、醇沉,离心取沉淀即得粗多糖。用水将其复溶后,加1/10体积的30%双氧水至粗多糖溶液中,50 ℃恒温至溶液无色。采用Sevag法脱蛋白,即向粗多糖水溶液中加入1/3体积的氯仿-正丁醇(两者体积比为5∶1)混合溶液,剧烈震荡20 min后静置至溶液分层,取上层多糖溶液,重复上述步骤多次直至静置后可分为两层清澈的溶液。透析48 h,浓缩后于-50 ℃冷冻干燥24 h。

用双蒸水配制成0.1 g/mL的多糖溶液,进DEAE-cellulose 52 色谱柱,以0.3 mol/L NaCl洗脱,洗脱流速为0.5 mL/min。然后,采用苯酚硫酸法,490 nm处所测吸光度表示每管洗脱液中的多糖含量。以管数为横坐标,A490为纵坐标,作洗脱曲线。根据洗脱曲线确定洗脱峰对应的收集管,分别收集相应洗脱液流出组分后透析24 h、浓缩、冻干。用双蒸水将上述多糖干粉配制成0.1 g/mL的多糖溶液,进Sepharose CL-6B色谱柱,用0.9% NaCl洗脱,洗脱液流速为0.5 mL/min,按上述方法做洗脱曲线,并收集分级分离后的主要组分,透析24 h、浓缩、冻干。

1.2.2 LEP2b-SeNPs的制备和表征

参考文献[14]的方法并稍作修改。将不同质量浓度的LEP-2b粉末溶于100 mL超纯水中制备LEP-2b溶液,新鲜制备40 mmol/L抗坏血酸溶液,在磁力搅拌下将LEP-2b溶液滴加到1 mL亚硒酸钠溶液(100 mmol/L)中,然后将10 mL 40 mmol/L抗坏血酸溶液添加到混合物中,反应结束后将反应液移至透析袋中,置于蒸馏水中于4 ℃条件下避光透析24 h,每隔2 h换1次蒸馏水,透析产物经冷冻干燥所得样品即为LEP2b-SeNPs,避光保存备用。

用胶头滴管滴加2滴LEP2b-SeNPs溶液到日立HT-7700 透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)专用铜网上,置于40 ℃烘箱内干燥后,放在TEM上进行观察。将LEP2b-SeNPs配制成不同质量浓度的悬浮液,利用纳米粒度仪检测粒径分布。将LEP2b-SeNPs存储在4、25 ℃、60 d以确定其稳定性。

1.2.3 H22荷瘤小鼠模型建立

雄性ICR小鼠58只,体质量为(20±2) g,购自安徽医科大学实验动物中心。饲养环境的温度为(23±2) ℃,湿度为(55±5)%,光照/黑暗周期为12 h。购置后,将小鼠先放置在实验环境中适应性饲养1周,在此期间给小鼠自由进食和进水,所有涉及动物的实验均严格按照合肥工业大学实验动物研究所建立的准则进行。

参照文献[15]的方法并略作修改。将H22细胞在完全培养基中培养4 d,使其细胞活性达到最高后在1 000 r/min的转速下离心3 min,然后用PBS洗涤3次,收集细胞。然后用无菌生理盐水将H22细胞密度调整至2×106个/mL,吹打均匀,制成细胞悬液。选取10只小鼠,腹腔注射H22细胞悬液(0.2 mL/只)进行细胞体内增殖。将小鼠常规饲养7 d后,将腹水形成良好的小鼠用乙醚麻醉,全身消毒后,在无菌超净工作台中用注射器吸出腹水。吸出的腹水在3 000 r/min的转速下离心10 min,获得细胞沉淀,用无菌生理盐水洗涤沉淀3次,制成建模用细胞悬液(1×107个/mL)。选取32只健康小鼠,将建模用细胞悬液以0.2 mL/只的剂量接种到小鼠的右腋下，继续常规饲养4 d后选取肿瘤直径在0.5 cm左右的小鼠作为H22荷瘤模型小鼠。

低剂量LEP2b-SeNPs处理组(L组):尾静脉注射750 μg/(kg·d)的LEP2b-SeNPs;高剂量LEP2b-SeNPs处理组(H组):尾静脉注射2 500 μg/(kg·d)的LEP2b-SeNPs;阳性药物组(5-Fu组):尾静脉注射50 mg/(kg·d)的5-氟尿嘧啶;毒性组(D组):对正常小鼠的尾静脉注射2 500 μg/(kg·d)的LEP2b-SeNPs;空白对照组(N组)和模型对照组(M组):每天尾静脉注射同等体积的生理盐水。

每天记录小鼠的摄食量、体质量及行为变化。在末次处理后,将小鼠禁食1夜。乙醚麻醉后,摘除眼球收集的血液于无菌离心管中,最后将小鼠脱颈处死。小鼠死亡后,立即对小鼠进行解剖,用生理盐水(4 ℃)清洗后,将上述各组织的一部分用4%多聚甲醛固定,另一部分经液氮迅速冷冻后,保存于-80 ℃冰箱。无菌离心管中的血液一部分用于血细胞分析,另一部分待血液凝固后,将其在3 000 r/min的转速下离心10 min分离血清,分离后的血清保存在-80 ℃冰箱,备用。

1.2.4 免疫组织化学检测

根据文献[16]的方法并稍作修改。免疫组织化学检测方法按照制造商的说明进行(Dako LSAB试剂盒,Carpinteria)。将玻片在10 mmol/L柠檬酸钠(pH值为6.0)中煮沸30 min进行抗原修复,再将载玻片与一抗在4 ℃下孵育过夜。然后,将玻片与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗一起孵育,在3,3′-二氨基联苯胺(DAB)中显影,用苏木精复染,并固定在树脂中。

1.2.5 生化指标的测定

用冷的生理盐水以1∶9(肝的质量与盐水体积)的比例匀浆肝组织,离心(2 500g,10 min),并收集上清液。使用生化试剂盒测定血清中谷草转氢酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)的活性;肝脏中过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)的活性,用ELISA试剂盒检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-1β(IL-1β)和γ-干扰素(IFN-γ)的水平。以上均依据试剂盒的说明书进行测定。

1.2.6 统计学分析

使用SPSS 22.0软件对本实验得到的数据进行统计学分析。所有数据均表示为(平均值±标准差)。单向方差分析(ANOVA)用于确定组间数据的显著性水平。若P<0.05，则认为组间存在显著性差异。与模型组相比，*P<0.05具有显著差异;与正常组相比，#P<0.05 具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 LEP2b-SeNPs的制备及表征结果分析

纳米颗粒的粒径和稳定性对于细胞摄取影响很大[17-18]。本文制备的LEP2b-SeNPs如图1所示,粒径随LEP-2b质量浓度的变化情况如图2所示。由图2可知,当LEP-2b的质量浓度为0～0.48 mg/mL时,SeNPs的粒径随质量浓度的增加而减小;当添加的LEP-2b质量浓度为0.48～0.80 mg/mL时,粒径大小趋于增大,表明SeNPs的粒径与LEP-2b的质量浓度有关。

图1 制备的LEP2b-SeNPs=

图2 SeNPs的粒径与LEP-2b质量浓度的关系

利用纳米粒度仪测定SeNPs和LEP2b-SeNPs的粒径分布范围，结果如图3所示。由图3可知,未修饰的SeNPs的平均粒径为620.5 nm,而用0.48 mg/mLLEP-2b制备的LEP2b-SeNPs粒径大小均一,集中分布在较窄的区域,平均粒径显著减小,小于100 nm,表明合成的LEP2b-SeNPs粒子具有良好的纳米尺度。SeNPs和LEP2b-SeNPs(反应时添加0.48 mg/mL LEP-2b)的粒径分布分别为220.20～1 281.00 nm和32.67～220.20 nm。

(a) SeNPs

(b) LEP2b-SeNP图3 SeNPs和LEP2b-SeNP的粒径分布

制备的LEP2b-SeNPs溶液在4、25 ℃下放置2个月后呈透明红色液体,无明显聚集和沉淀,而SeNPs沉淀明显,表明LEP2b-SeNPs比SeNPs具有更好的稳定性。SeNPs和LEP2b-SeNPs的TEM图如图4所示。由图4可知,在没有LEP-2b的情况下,SeNPs倾向于聚集和沉淀,而用0.48 mg/mL LEP-2b制备的LEP2b-SeNPs分散均匀。

图4 SeNPs和LEP2b-SeNPs的TEM图

2.2 LEP2b-SeNPs对小鼠的影响

通过小鼠腋下皮下注射H22肿瘤细胞建立移植实体瘤模型,评价LEP2b-SeNPs对小鼠肝癌的作用。不同处理组小鼠的肿瘤体积和质量如图5所示。从图5可以看出,对各组小鼠处理9 d后,在所有处理组中均观察到肿瘤体积减小,发现低剂量比高剂量LEP2b-SeNPs对小鼠移植性肿瘤显示出更加明显的抑制作用,低剂量LEP2b-SeNPs和阳性药组的小鼠瘤质量与模型组相比差异极其显著(P<0.001)。

图5 不同处理组小鼠的肿瘤质量

不同处理组干预期间小鼠的体质量及摄食量随天数的变化如图6所示。由图6可知,正常组和单独使用LEP2b-SeNPs(D组)的小鼠精神状态良好,体质量较平稳,毛发光亮,无死亡现象发生,表明小鼠对LEP2b-SeNPs的剂量具有良好的耐受性;模型组小鼠在整个实验过程中绝大部分精神状态不佳,小鼠体质量由于荷瘤也有所增加;在5-Fu处理后,小鼠的体质量相较于模型组显著下降,且表现出行动迟缓、神情呆滞,说明5-Fu可能对小鼠造成副作用;与模型组相比,LEP2b-SeNPs组小鼠活跃,精神状态良好,但体质量增加不明显。另外,在摄食量方面,正常组小鼠的食物摄取随体质量增加。然而,模型组和5-Fu组的小鼠食物摄入量随天数减少,而LEP2b-SeNPs组小鼠的食物摄入量相对稳定。

图6 不同处理组小鼠的体质量及摄食量随时间的变化

2.3 对H22荷瘤小鼠蛋白表达的影响

Ki-67主要用于判断细胞的增殖活性[19],因此采用免疫组织化学法检测荷瘤小鼠肿瘤中Ki-67的表达水平,结果如图7、图8所示。

图7 不同处理组小鼠肿瘤Ki-67的免疫组织化学结果

从图7、图8可看出,模型组小鼠的肿瘤Ki-67表达很强,与模型组相比,低剂量LEP2b-SeNPs组的小鼠肿瘤细胞核中观察到弱阳性信号(P<0.01),比高剂量组显著性高(P<0.05),这说明低剂量LEP2b-SeNPs有效抑制了癌细胞增殖。

图8 不同处理组小鼠肿瘤Ki-67的IOD值

2.4 LEP2b-SeNPs对小鼠生化指标的影响

本文检测H22荷瘤小鼠血清中的免疫因子(包括TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-1β),不同处理组小鼠的血清、肝脏生化因子水平结果如图9所示。

图9 不同处理组小鼠的血清、肝脏生化因子水平

从图9可以看出,5-Fu处理后,血清中IFN-γ、IL-1β、IL-2和TNF-α的水平发生了不同程度的下降,表明5-Fu对小鼠的免疫系统具有免疫抑制作用;LEP2b-SeNPs处理后,血清中IFN-γ、IL-1β、IL-2和TNF-α的水平明显升高(P<0.05或P<0.01);同时,在毒性组也发现了IFN-γ、IL-1β的上调。以上结果表明,LEP2b-SeNPs能诱导免疫细胞向肿瘤组织中浸润、提高机体免疫因子水平,激活免疫系统。

通过试剂盒检测了肝功能损伤的关键生物标志物。在肝脏受损时,肝细胞功能被破坏,肝细胞膜通透性增加,继而细胞中的各种酶(包括AKP和AST),就会由细胞释放到血清中,从而引起血清中这些酶的酶活增加[20]。结果表明,与正常组相比,模型组的小鼠血清AST和AKP水平明显增加(P<0.01);与模型组比,低剂量的LEP2b-SeNPs和5-Fu处理可显著降低这2个指标的水平(P<0.01)。

CAT属于机体的抗氧化防御系统。MDA是机体脂质过氧化程度的标志之一,其过量产生能加剧组织的损伤[21]。5-Fu处理降低了小鼠肝脏中CAT的活性,提高了MDA的水平,与正常组小鼠相比差异有显著性(P<0.01),表明5-Fu破坏了机体的抗氧化防御系统。与模型组相比,低剂量LEP2b-SeNPs处理提高了荷瘤小鼠肝脏中CAT水平,降低了MDA的水平(P<0.01)。以上结果表明,低剂量LEP2b-SeNPs能显著减轻荷瘤小鼠的氧化应激。

3 结论

本研究结果表明，LEP2b-SeNPs比SeNPs具有更小的粒径、分散性及稳定性。文献[14]发现纳米硒桔梗多糖大小均一、分散均匀,放置2个月后仍呈透明红色液体且基本无沉降。此外,文献[22]制备的昆布多糖纳米硒也是均一、球形的单分散粒子,稳定性比未修饰的SeNPs相比大大增强。显然本研究结果与先前的研究结果类似。干预期间,模型组小鼠体质量明显上升,阳性药物组的小鼠体质量显著降低,模型组和阳性药物组的小鼠食物摄入量随天数明显下降,而LEP2b-SeNPs处理组小鼠的体质量和食物摄入量相对稳定。低剂量LEP2b-SeNPs的体内抗肿瘤活性大于高剂量组,原因可能是低剂量LEP2b-SeNPs有效抑制了小鼠肿瘤生长及肿瘤细胞的增殖,增加血清中的免疫因子(IFN-γ、IL-1β、IL-2和TNF-α)的质量浓度,继而激活抗肿瘤免疫系统从而抑制肿瘤的生长。低剂量LEP2b-SeNPs还可降低荷瘤小鼠血清AST、AKP水平,降低肝脏MDA,提高肝脏CAT水平,说明它可以增强小鼠体内抗氧化酶活性,减轻氧化应激。因此,本研究发现了一种新的可用于制备纳米硒的材料粒毛盘菌多糖,从而拓宽了粒毛盘菌多糖的应用范围。为开发粒毛盘菌多糖新型抗肿瘤产品提供了科学依据,也为其他活性产品的开发奠定了基础。