包瑞婷，吐玛热斯·塔外库力，哈斯也提·依不来音

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种与衰老相关的神经退行性疾病［1］，也是痴呆最常见的一种形式，占全球4 680万痴呆患者的60%以上［2］，其发病机制复杂，已成为老年人死亡的主要原因之一［3］。目前国际上还没有有效预防或减缓AD进展的方法［4］。在临床上，根据遗传特点，AD可分为散发性和家族性，其中后者仅占5%［5］。AD的发病机制目前还没有明确定论，但研究表明，遗传因素在AD发病中可能发挥了重要作用［6］。随着AD分子遗传学研究的进展，大量研究表明，聚集素（clusterin，CLU）基因突变及其分子结构可通过增加β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）在大脑中的沉积等方式增加AD发生率［7］。全基因组关联分析（genome-wide association studies，GWAS）发现，目前CLU基因已经成为除载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）和桥接整合因子1（bridging integrator 1，BIN1）外可能导致AD的第三大风险因子［8］。由于AD的患病率、等位基因频率和连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）模式在不同人群之间存在差异，故本研究通过对比新疆地区汉族、维吾尔族散发性AD患者与非AD受试者CLU基因多态性，探索CLU基因多态性与散发性AD的关联性，以期为AD发病机制的探讨提供借鉴。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2017年8月至2019年6月在新疆医科大学第二附属医院、新疆医科大学第七附属医院、乌鲁木齐市六道湾医院就诊的散发性AD患者131例为病例组。纳入标准：（1）符合美国《精神疾病诊断与统计手册》［9］中痴呆的诊断标准和“很可能AD”的诊断标准；（2）在新疆地区居住时间＞10年；（3）年龄≥65岁；（4）民族：汉族或维吾尔族。排除标准：（1）由抑郁症等引起的假性痴呆患者；（2）目前正处于心、血管、肺、肝、肾等脏器或组织疾病急性期的患者；（3）快速进展性痴呆患者；（4）血管性痴呆患者；（5）其他神经系统疾病和食物或药物中毒引起的痴呆患者；（6）患有任何肿瘤的患者；（7）因听力障碍、视力障碍等易引起认知功能下降的患者。选取同期在新疆医科大学第二附属医院进行体检的非AD患者或健康志愿者128例为对照组。纳入标准：（1）年龄≥65岁；（2）民族：汉族或维吾尔族；（3）在新疆地区居住时间＞10年；（4）与AD患者生活环境、饮食习惯相似；（5）无AD家族史。排除标准：不能确诊的疑似AD患者。两组性别、年龄、民族、文化程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 病例组与对照组一般资料比较Table 1 Comparison of general data between case group and control group

1.2 CLU基因多态性测定方法 于病例组入院后第4天、对照组体检当天清晨采集其空腹外周静脉血3 ml，采用TIANamp Genomic DNA kit提取试剂盒〔天根生化科技（北京）有限公司生产〕提取DNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。采用PCR及DNA测序检测CLU基因单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNP），其中SNP位点信息全部来自NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/），搜索并记录目标基因座的准确序列。CLU基因SNP（rs11136000、rs1532278）位点的基因分型由博淼生物科技（北京）有限公司采用连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）-PCR法完成。CLU基因SNP位点引物序列见表2。

表2 CLU基因SNP位点引物序列Table 2 Primer sequence of CLU gene SNP site

1.3 统计学方法 采用PLINK 1.07软件进行统计学分析。计量资料经正态性检验均符合正态分布，以（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；汉族受试者发生散发性AD的影响因素分析采用加性模型分析；采用Haploview软件计算CLU基因上rs11136000-rs1532278单体型基因型（TT和CC）频率。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组与对照组汉族、维吾尔族受试者SNP位点基因型及等位基因频率比较 病例组与对照组汉族受试者rs11136000、rs1532278位点基因型比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；病例组汉族受试者rs11136000、rs1532278位点TC基因型占比低于对照组，CC基因型占比高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；病例组与对照组汉族受试者rs11136000、rs1532278位点等位基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3～4。病例组与对照组维吾尔族受试者rs11136000、rs1532278位点基因型及等位基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5～6。

表3 病例组与对照组汉族受试者rs11136000位点基因型及等位基因频率比较〔n（%）〕Table 3 Comparison of genotype and allele frequency of rs11136000 site in Han participants between case group and control group

表4 病例组与对照组汉族受试者rs1532278位点基因型及等位基因频率比较〔n（%）〕Table 4 Comparison of genotype and allele frequency of rs1532278 site in Han participants between case group and control group

表5 病例组与对照组维吾尔族受试者rs11136000位点基因型及等位基因频率比较〔n（%）〕Table 5 Comparison of genotype and allele frequency of rs11136000 site in Uygur participants between case group and control group

表6 病例组与对照组维吾尔族受试者rs1532278位点基因型及等位基因频率比较〔n（%）〕Table 6 Comparison of genotype and allele frequency of rs1532278 site in Uygur participants between case group and control group

2.2 汉族受试者发生散发性AD影响因素的单因素Logistic回归分析 分别以汉族受试者rs11136000、rs1532278位点基因型（赋值：TT=1，TC=2，CC=3）、等位基因为自变量（赋值：T=1，C=0），散发性AD发生情况为因变量（赋值：发生=1，未发生=0），进行加性模型分析，结果显示，rs11136000、rs1532278位点等位基因T是汉族受试者发生散发性AD的保护因素（P＜0.05），见表7。

表7 汉族受试者发生散发性AD影响因素的加性模型分析Table 7 Additive model analysis of influencing factors of sporadic AD in Han participants

2.3 病例组汉族与维吾尔族受试者SNP位点基因型及等位基因频率比较 病例组汉族与维吾尔族受试者rs11136000、rs1532278位点基因型比较，差异有统计学意义（χ2值分别为15.514、14.649，P值分别为＜0.001、0.001）；病例组汉族受试者rs11136000、rs1532278位点TT、TC基因型占比低于维吾尔族，CC基因型占比高于维吾尔族，差异有统计学意义（P＜0.05）。病例组汉族受试者rs11136000、rs1532278位点等位基因T频率低于维吾尔族，差异有统计学意义（χ2值分别为16.843、17.053，P值均＜0.001）。

2.4 CLU基因上rs11136000-rs1532278单体型基因型频率 病例组与对照组汉族受试者CLU基因上rs11136000-rs1532278单体型基因型频率比较，差异无统计学意义（χ2=2.885，P=0.091）。病例组与对照组维吾尔族受试者CLU基因上rs11136000-rs1532278单体型基因型频率比较，差异无统计学意义（χ2=0.603，P=0.438）。病例组汉族受试者CLU基因上rs11136000-rs1532278单体型TT基因型频率高于维吾尔族，差异有统计学意义（χ2=17.741，P＜0.001），见表8、图1。

图1 CLU基因上rs11136000-rs1532278单体型基因型分布的连锁不平衡图Figure 1 Linkage disequilibrium diagram for haplotypes of CLU gene rs11136000-rs1532278

表8 对照组、病例组汉族、维吾尔族受试者CLU基因上rs11136000-rs1532278单体型基因型频率〔n（%）〕Table 8 Genotype frequency of rs11136000-rs1532278 haplotype in CLU gene of Han and Uygur subjects in control group and case group

3 讨论

AD依据其发病人群特点可分为家族性AD和散发性AD，而CLU基因是散发性AD的风险基因［10］，位于人类第八号染色体上（8p21-12）［11］。自2009年LAMBERT等［12］发现CLU基因的3个位点（rs11136000、rs2279590和rs9331888）与高加索人群AD易感性有关以来，CLU基因多态性与AD的相关性一直是全世界的研究热点。AD主要病理特征是大脑中含Aβ多肽的老年斑的表达、形成和沉积增加。CLU基因多态性已被证实可促进Aβ在大脑中的沉积，尤其是在额叶、扣带回的沉积，其中携带rs11136000位点CC基因型的受试者比携带TC基因型的受试者Aβ沉积多，而携带TT基因型的受试者Aβ沉积最少［8］。由此说明，CLU基因多态性可通过增加Aβ在大脑功能区的沉积而引发AD。芬兰的一项病例对照研究发现，CLU基因rs11136000位点等位基因C可使脑脊液中Aβ1-42明显降低［13］。而目前已知的AD相关风险基因位点中，只有ApoEε4等位基因可使脑脊液中Aβ1-42明显降低，提示CLU基因rs11136000位点等位基因C与ApoE ε4在AD的发生中具有类似的生物学功能。当脑脊液中的Aβ1-42降低时，意味着Aβ1-42滞留于大脑淀粉样斑块中，同样说明CLU基因变异是通过调节AD的生物标志物Aβ在大脑中的沉积而诱导发病的。此外，相关影像学研究也证明了CLU基因多态性与脑白质微结构改变［14］以及海马体萎缩［15］有关，这种脑白质微结构的变化反映了脑白质发育的脆弱性，而这种脆弱性降低了脑白质对AD相关神经病理的恢复能力，并可能会导致脑白质血供减少。更有研究表明，CLU基因多态性可促进轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI）向AD发展，该研究的受试者基线时认知功能正常，但在随后发生MCI或AD的个体中，携带rs11136000位点等位基因C者的认知功能衰退速度明显快于未携带rs11136000位点等位基因C者，该研究证明CLU基因rs11136000位点等位基因C是MCI向AD进展的独立危险因素，从遗传学角度使CLU基因座在MCI向AD进展中具有独立贡献这一假设成立［16］。因此，很多科学家致力于研究CLU基因多态性与AD的相关性，但研究结果因目标人群及地区而异。目前，尚未见以我国居民为研究对象分析CLU基因多态性与AD之间相关性的研究，针对新疆地区的相关研究目前仅有1项，该研究指出CLU基因rs11136000位点多态性与新疆哈萨克族人群发生AD可能有关［17］。但有学者认为，样本量小、研究设计不完备或研究对象间异质性均会导致研究结果不同［3］。一项针对我国华南地区汉族人群的研究显示，rs1136000位点多态性与AD无相关性［18］。因此对于CLU基因多态性与新疆地区汉族人群和维吾尔族人群AD易感性之间的关系仍需进一步研究，本研究旨在分析CLU基因多态性与散发性AD的关联性。

本研究结果显示，病例组汉族受试者rs11136000、rs1532278位点TC基因型占比低于对照组，CC基因型占比高于对照组，提示在新疆汉族人群中CLU基因rs11136000、rs1532278位点基因型分布差异可能与散发性AD易感性有关。加性模型分析结果显示，rs11136000、rs1532278位点等位基因T是汉族受试者发生散发性AD的保护因素，提示新疆汉族人群携带等位基因T可降低散发性AD发生风险。MORENO等［19］在哥伦比亚进行的一项病例对照研究显示，携带CLU基因rs11136000位点等位基因T与AD发生风险降低有关。然而，本研究结果显示，病例组与对照组维吾尔族受试者rs11136000、rs1532278位点基因型及等位基因频率比较差异无统计学意义，这与大多数民族的研究结果一致，如BOCHAROVA等［20］研究显示，在俄罗斯人群中，AD组和健康对照组CLU基因rs1532278位点等位基因频率、基因型和单倍体无明显区别；SHANKARAPPA等［21］在印度南部开展的一项CLU基因多态性与AD患者及认知功能正常人群之间的关系研究证实，CLU基因rs11136000位点多态性与AD无关联〔OR=1.64，95%CI（0.78，3.42），P=0.18〕；2020年SANTOS等［22］在巴西东南部实施的一项病例对照研究证实，CLU基因rs11136000位点等位基因T与AD发病风险无关〔OR=0.840，95%CI（0.537，1.314），P=0.445〕。这些研究结果说明不同地区、民族人群CLU基因多态性与AD易感性之间的关系很复杂。考虑到新疆地域宽广、民族众多，本研究进一步分析病例组汉族与维吾尔族受试者rs11136000、rs1532278位点基因型及等位基因频率，结果显示，病例组汉族受试者rs11136000、rs1532278位点TT、TC基因型占比低于维吾尔族，CC基因型占比高于维吾尔族；病例组汉族受试者rs11136000、rs1532278位点等位基因T频率低于维吾尔族；证明在新疆汉族和维吾尔族人群中，导致散发性AD易感性的基因突变位点并不都是同一位点，两民族间致病基因位点存在差异，分析原因，本研究组考虑如下：（1）可能与两民族生活习惯及饮食习惯的差异有关；（2）可能与散发性AD的发病机制复杂有关，且容易受环境因素、遗传因素等的影响，单一的民族因素无法解释CLU基因多态性与散发性AD之间的相关性；（3）可能与本研究样本量小、代表性不全面有关，尚需要大样本量、多因素的实验分析解释其原因。此外，本研究结果显示，病例组与对照组汉族受试者CLU基因上rs11136000-rs1532278单体型基因型频率比较差异无统计学意义，病例组与对照组维吾尔族受试者CLU基因上rs11136000-rs1532278单体型基因型频率比较差异无统计学意义，提示汉族散发性AD患者与非AD人群、维吾尔族散发性AD患者与非AD人群单体型基因型分布均无差异。病例组汉族受试者CLU基因上rs11136000-rs1532278单体型TT基因型频率高于维吾尔族，提示CLU基因rs11136000、rs1532278位点基因型、等位基因分布在汉族与维吾尔族散发性AD患者中具有明显差异。

综上所述，CLU基因rs11136000、rs1532278位点多态性与新疆汉族人群发生散发性AD有关，其中携带等位基因T可降低其散发性AD发生风险；此外，rs11136000、rs1532278位点多态性在新疆汉族与维吾尔族散发性AD患者中存在明显差异。但本研究样本量较小，样本来源未覆盖整个新疆地区，因此研究结果并不能很好地代表整个新疆地区，仍有待更大样本量的研究来进一步验证本研究结论。

志谢：感谢新疆医科大学第七附属医院、乌鲁木齐市六道湾医院在本研究病例收集过程中的大力支持。

作者贡献：包瑞婷、哈斯也提·依不来音进行文章的构思与设计；包瑞婷、吐玛热斯·塔外库力进行研究的可行性分析及实施；包瑞婷进行数据收集、整理、分析及结果解释，并撰写论文；哈斯也提·依不来音进行文章的质量控制和审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。