王向东 姜 敏 王 鑫 巩永凤*

(1.滨州医学院生理学教研室，山东烟台 264000；2.滨州医学院药理学教研室，山东烟台 264000；3.青岛大学病理生理学教研室，山东青岛 266000)

肾损伤是一个全球性疾病，具有高发病率、高病死率和低治愈率的特点，多由缺血再灌注、肾毒性药物的使用和脓毒败血症等病因导致[1-2]。其中，缺血再灌注是肾损伤的主要诱因，主要有肾功能下降，血清中含氮废物排出减少等临床表现。肾小管的损伤与修复是肾功能损伤程度的主要标志[1]，当损伤因素过强应激反应不能及时被终止时，则会导致肾功能的进一步损伤并促使之后一系列不可逆过程的发生，沿着急性肾损伤→慢性肾功能衰竭→终末期肾病→尿毒症这一过程进展[3-5]。因此，探究肾损伤发生发展的机制并找到有效延缓肾损伤发展的治疗方法，对目前临床治疗肾损伤从而提高肾损伤患者生活质量尤为重要。

缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)诱导肾损伤的具体致病机制至今尚未完全阐明，目前已有研究[6-8]报道与之有关的有炎症反应、上皮间质转分化、内质网应激和线粒体损伤等原因，其中炎性反应在肾损伤的发生和发展过程中起到了至关重要的作用，肾损伤和炎性反应相关通路有关。

糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)作为一个主要靶点，在炎性反应的发生过程中起到了至关重要的作用。GR分布于全身各个组织和细胞内，正常情况下，大部分存在于细胞胞质内，和热休克蛋白结合以维持其正常构象；当受到某些激活因子刺激后，GR和热休克蛋白分离并发生转位，进入细胞核内，发挥其转录特性，减弱相应转录因子的活性[9-10]。探究GR在IR诱导的肾损伤中的作用，不仅可以探究炎性反应在IR诱导的肾损伤中的作用方式，同时也有助于发现在肾损伤中更多与GR相关联的分子，从而对肾损伤进一步深入的了解。

本研究通过构建IR诱导小鼠肾损伤模型，观察肾小管在该过程中的损伤与修复；通过注射米非司酮(mifepristone, MF)阻断GR入核，进一步加重肾损伤和炎性反应，深入探究了GR在肾损伤中的作用，为进一步探究GR在肾损伤中的作用提供合适的模型和方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄C57BL/6雌性小鼠，体质量约20～22 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物许可证号：SCXK(鲁)2019-0003。自由饮水摄食，12 h光照周期。伦理审批号：2021-172。

1.2 试剂

Trizol(美国Ambion公司)；实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；米非司酮(美国MCE生物科技公司)；RIPA裂解液、血肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)试剂盒(南京建成科技有限公司)；DAPI(北京索莱宝科技有限公司)；蛋白质浓度定量试剂盒(日本Takara公司)；反转录试剂盒(日本Takara公司)；肾损伤分子-(kidney injury molecular-1，Kim-1)抗体、GR抗体、巨噬细胞表面标志物F4/80抗体、HRP标记的山羊抗兔二抗(美国CST公司)；近端小管标志物Lotus Tetragonolobus Lectin(LTL)(美国Vector Laboratories公司)。

1.3 实验分组及处理

小鼠数字表法随机分为5组，每组10只，用来验证模型构建成功以及 GR 在缺血再灌注过程中的变化，分别为空白对照组，缺血再灌注后4、14、30和79 d组。

另外再取20只小鼠，数字表法随机分为两组，每组10只分别作为MF组和对照组，用来验证MF对肾损伤的影响，将MF溶解于DMSO中，使用时用玉米油稀释，于缺血再灌注的前一天，MF组小鼠腹腔注射含有MF的溶剂，对照组注射等剂量但不含药物的相同溶剂，以排除DMSO和玉米油对肾脏的影响。

1.4 IR模型构建

小鼠适应环境1周后，腹腔注射20 mg/kg的戊巴比妥钠麻醉，待完全麻醉后备皮，置于38 ℃金属水浴锅上10 min以恢复体温。胶带固定四肢，碘伏消毒，剪开左侧皮肤，暴露单侧肾脏以及肾蒂，使用微血管夹，夹闭动静脉45 min后，取下微血管夹，恢复肾脏血液供应，缝合皮肤。缺血再灌注后4、14、30、79 d组分别于处理前一天麻醉后切除对侧肾脏，次日摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠，取出肾脏。

1.5 肾组织取材

每组取6只小鼠的肾脏使用Trizol匀浆，提取RNA，进行RT-qPCR。取2只小鼠的肾脏沿纵轴切开，一半使用4%(质量分数)多聚甲醛固定，常规脱蜡、浸石蜡包埋切片进行过碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff staining，PAS)、苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)。一半OCT包埋，置于-80 ℃冰箱，用于免疫荧光染色；其余小鼠肾脏取出后置于液氮速冻，置于-80 ℃冰箱，用于蛋白质印迹技术(Western-blotting，WB)检测。

1.6 血清的制备及保存

血液室温静置2 h后，4 ℃，3 000g离心15 min。收取上清，-80 ℃冻存。

1.7 肾组织RNA提取

去除肾脏被膜，置于1.5 mL Trizol内，匀浆30 s。取1 mL匀浆后的液体置于1.5 mL EP管内，室温静置10 min，加入氯仿200 μL/mL，用力震荡15次充分混匀，室温静置3～5 min，4 ℃，12 000g离心15 min。溶液分3层，分2次取出上层400 μL水相置于新的1.5 mL EP管内，加入预冷的异丙醇500 μL，翻转4～5次混匀，室温静置10 min。4 ℃，12 000g离心10 min。弃上清，1 mL 75%(体积分数)乙醇洗2遍，4 ℃，7 500g离心5 min，加入DEPC水置于金属水浴锅内55 ℃孵育10 min溶解RNA，置于-80 ℃冰箱，用于RT-qPCR。

1.8 RT-qPCR

按照试剂盒说明进行反转录和荧光定量PCR，最终结果使用循环阈值(CT值)减去β-actin的CT值，计算目的基因的2-△△Ct值，比较目的基因相对表达水平。引物序列详见表1。

表1 mRNA引物序列(小鼠)

1.9 肾组织免疫荧光染色

将OCT包埋的肾组织使用冷冻切片机切成8 μm厚度，甲醇-20 ℃固定20 min，使用含10%(体积分数)胎牛血清和1%(体积分数)Tween 20的PBS封闭液封闭90 min，一抗为兔抗GR单克隆抗体(1∶200)和鼠抗F4/80单克隆抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜，封闭液洗3次，二抗兔抗罗丹明和鼠抗FITC、肾脏近端小管染料LTL(1∶400)，室温孵育2 h，封闭液洗3遍，DAPI室温避光染核5 min，封闭液洗3遍，封片。使用880激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM880，德国蔡司)观察拍照。

1.10 蛋白质印迹实验

从-80 ℃取出肾脏，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，匀浆后用2 mL注射器抽吸50次以充分裂解组织，置于4 ℃翻转混匀30 min，4 ℃，12 000g离心15 min，取上清，BCA法测浓度后调整上样量。按照实验分组加入蛋白样品，10%(质量分数)Tris-HCL SDS聚丙烯酰胺凝胶分离，转移到硝酸纤维素膜上恒流200 mA转膜2 h，然后使用5%(质量分数)脱脂奶粉室温封闭1.5 h，4 ℃孵育一抗(抗GR、抗β-actin抗体，1∶1 000)过夜。次日TBST清洗3次后，避光孵育二抗(HRP标记的山羊抗小鼠IgG，1∶2 000)室温1 h，使用ECL发光液孵育2 min后显影。

1.11 肾组织PAS和HE染色

取出4%(质量分数)多聚甲醛固定的肾脏，按照常规组织脱水浸蜡切片步骤[11]，进行组织学染色，光学显微镜观察肾组织炎性细胞浸润和损伤情况。

1.12 MF干预

MF是GR阻断剂。先用DMSO将MF粉末配溶解成100 mg/mL的原液，使用时再用玉米油稀释成10倍工作液，实验组于缺血再灌注手术前一天开始第一次腹腔注射，每次注射剂量为50 mg/kg，每天注射1次，连续注射15 d，以阻断GR入核[12-13]；对照组注射等剂量玉米油和DMSO 混合溶剂。

1.13 统计学方法

2 结果

2.1 缺血再灌注对小鼠肾功能影响

肾脏缺血再灌注构建过程(图1A)。通过BUN和Scr试剂盒检测小鼠肾功能发现，与空白组相比，肾脏缺血再灌注组小鼠各观察时间点的BUN和Scr均高于对照组，差异有统计学意义。BUN：F=200.6，P<0.01，每组值分别为：空白组：(16.06±1.05)mg/dL，单侧缺血再灌注(unilateral ischemia-reperfusion, UIR)(day 4)+单侧肾切除(unilater nephrectomy, UNX)(day 1):(78.43±3.51)mg/dL，UIR(day 14)+UNX(day 1):(29.24±2.92)mg/dL，UIR(day 30):(23.94±5.07)mg/dL，UIR(day 79)+UNX(day 1):(19.81±5.83)mg/dL。Scr：F=63.43，P<0.01，每组值分别为：空白组：(0.20±0.07)mg/dL，UIR(day 4)+UNX(day 1)：(1.67±0.32)mg/dL，UIR(day 14)+UNX(day 1):(1.12±0.07)mg/dL，UIR(day 30)+UNX(day 1):(0.34±0.06)mg/dL，UIR(day 79)+UNX(day 1):(0.35±0.07)mg/dL；n=6。再灌注后第4天组BUN和Scr浓度最高，随后逐渐降低(图1B)。PAS染色显示，模型组相比空白组小管结构紊乱，肾间质浸润细胞增多(图1C)。免疫荧光(immunofluorescence，IF)检测显示，和空白组相比，缺血再灌注第14天近端小管标志物LTL信号降低，Kim-1阳性信号明显增多，随后逐渐减弱(图1D)。

图1 缺血再灌注对小鼠肾功能的影响

2.2 GR和肾脏炎症反应的相关性

肾组织HE染色显示，缺血再灌注后肾间质会出现大量细胞聚集(图2A)。RT-qPCR检测结果显示，模型组巨噬细胞表面标志物F4/80、T细胞表面标志物CD3以及中性粒细胞表面标志物Ly6G均高于空白组，差异有统计学意义(F4/80:F=11.31，P<0.01；CD3:F=15.9，P<0.05；Ly6G：F=4.469，P<0.05，n=6)，详见图2B。IF检测显示，与空白组相比，模型组F4/80阳性信号明显增强，CD3阳性信号轻度增强，同时，GR的表达和炎性反应存在一个负相关性，详见图2C。

图2 肾脏炎症反应和GR的关系

2.3 GR在IR诱导肾损伤过程中的变化

RT-qPCR检测结果显示，GR的mRNA在IR诱导肾损伤后明显降低，与空白组比较差异有统计学意义(F=46.84，P<0.001，n=6)，急性期显著下降，但随观察时间的增加呈现逐渐恢复的趋势(图3A)。免疫荧光结果(图3B)和蛋白质印记实验结果表明，GR的蛋白质水平也呈现先降低后逐渐恢复的趋势(图3C)。

图3 GR在缺血再灌注过程中的变化

2.4 GR阻断后会加重IR诱导的肾损伤

腹腔注射MF后，实验组肾功能指标Scr和BUN均高于对照组，差异有统计学意义[BUN：50.82±3.91)mg/dLvs(60.45±3.20)mg/dL，P<0.01；Scr：(1.05±0.23)mg/dLvs1.71±0.08，P<0.01，n=6)]，说明肾功能损伤加重(图4A)。IF检测结果显示，使用米非司酮后F4/80和Kim-1阳性信号明显增强，说明炎性反应增强，肾损伤加重(4B，4C)。

图4 GR阻断对IR诱导肾损伤的影响

3 讨论

炎性反应参与了多种疾病的发生发展，当组织遭受应激性刺激时，受损细胞会释放大量促炎因子，募集炎症细胞引起炎性反应从而减轻损伤。随着损伤的消除，抑炎因子释放，炎性反应逐渐消退，开始进入组织修复过程。然而，过度和未被及时终止的炎症会导致免疫系统紊乱、组织损伤和纤维化的发生[14]。正常情况下，多种炎症细胞参与了机体稳态的维持和受损组织的重建，尤其是巨噬细胞，参与调节组织对损伤或应激因素的反应[15-17]。本实验在已有研究的基础上，进一步探究了近端小管的损伤与修复，包括肾损伤分子Kim-1的表达变化以及巨噬细胞、T细胞和中性粒细胞3种炎性细胞在肾损伤发展过程中浸润数量的变化。

肾小管是对IR和肾毒性药物损伤最敏感的部位，主要表现为肾小管上皮细胞凋亡，炎性反应的启动和纤维化的发生，如果损伤过强或者反复多次损伤，会导致肾脏的不适应性修复，进而导致肾纤维化和慢性肾衰竭[18-19]。本研究结果表明，IR会导致肾脏发生严重损伤，诱发大量的巨噬细胞，CD3+T细胞和中性粒细胞浸润，并且不同类型炎症细胞出现和消退的时间存在差异。肾损伤的免疫炎症由天然免疫和获得性免疫反应共同参与，二者在组织损伤和修复中均具有双刃剑效应，其复杂的调控网络远未阐明。比如，在疾病的不同阶段，不同的炎症细胞却起到了相反的效应，即便同样是巨噬细胞，不同分型的巨噬细胞对于肾脏的损伤和修复也起到了截然相反的效应。因此，探究炎性反应在肾损伤过程中的作用并且恰当地利用炎症反应治疗和控制肾损伤的发生发展尤为重要[20-22]。

GR作为机体炎性反应的重要靶点，存在于机体各种细胞，大部分位于细胞内，极少部分位于细胞膜上，在正常生理状态下，GR和热休克蛋白结合位于胞质内，当机体受到损伤而发生炎症反应时，糖皮质激素释放增多，糖皮质激素便会和GR结合，从胞质转移至细胞核内，结合在GRE区域，进而诱导下游靶基因表达，发挥其抗炎的作用。此外，GR还可以和一些核分子结合抑制其转录活性，比如核因子-κB和激活蛋白-1，减弱其促炎作用而发挥抗炎效应[23-25]。MF，俗称RU486是孕激素和糖皮质激素的竞争性拮抗剂，可以阻断糖皮质激素和GR以发挥其作用，注射MF阻断GR时，会导致炎性反应增强和器官损伤。有研究[26]显示，烧伤小鼠注射MF会逆转糖皮质激素的修复作用，使血管修复受阻，血管壁通透性增加，导致肺和肾功能严重受损，进而诱发多器官功能衰竭。此外，给脂多糖诱导的脓毒败血症小鼠注射MF后，发现MF抑制早期脓毒症中p38的激活，以及晚期脓毒症中p42/44 MAPK的激活[27]。然而，GR在IR诱导的肾损伤中的变化及作用尚未被深入探究。本研究表明，GR在IR诱导的肾损伤发生过程中存在时间依赖性，说明GR在该过程中起到了重要的作用。因此，探究GR在肾损伤过程中的作用，有望为临床治疗肾损伤提供一个新的药物靶点[9，28]。

MF作为孕激素和糖皮质激素受体阻断剂被大量研究，同时也已经作为避孕药在临床推广应用，截至目前，未发现 MF 在正常生理状态下对肾功能存在毒副作用[29-30]，已有研究[31]表明在肝肾功能正常的情况下，使用MF对肝肾功能没有影响。同时，本研究发现，在IR诱导的肾损伤中，腹腔注射MF阻断GR入核发挥转录调控作用时，肾小球滤过率相比对照组明显下降，肾损伤进一步加重。本实验还发现，腹腔注射MF会进一步导致IR诱导肾损伤后肾组织炎症细胞的浸润增多，加重肾脏损伤，说明肾脏中的GR可能通过抑制炎症细胞的浸润，进而保护肾脏免受IR诱导的损伤。

本次实验证实了GR和IR诱导肾损伤有明显的相关性并且起到了重要的作用，但作用的具体机制以及与炎症因子互作而调控炎性反应强度尚未阐明。接下来可以通过构建和GR相关分子的基因敲除小鼠，在IR诱导肾损伤模型的基础上，通过基因组学和蛋白质组学进一步验证和探究。本次通过在IR诱导的肾损伤小鼠模型上，注射MF阻断GR，证实了GR阻断后会进一步加重IR诱导的肾损伤，为今后深入探究GR在肾损伤发生发展过程中的具体机制提供实验思路和实验方法。