周仕群，王 聪，江 强，陈岳尧，符妹丽（儋州市人民医院肾内科，海南儋州 571179）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病患者常见的微血管并发症，也是引起终末期肾病及糖尿病患者死亡的主要原因之一[1]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类新型的调控人体基因组学的小分子RNA，其异常表达与炎症反应、糖脂代谢紊乱等密切相关，可能参与DN的发生发展[2-3]。有研究认为，miR-188-5p及miR-379-5p在DN患者中存在异常表达，其通过调控多种信号通路参与DN的发生发展，可能为DN的早期诊断及靶向治疗提供新的视野[4-5]。本研究通过检测2型糖尿病患者血清miR-188-5p及miR-379-5p表达水平，分析其与DN发生的相关危险因素及其诊断DN的价值，旨在为DN的诊疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月～2020年12月儋州市人民医院收治的2型糖尿病患者162例，其中男性95例，女性67例，年龄38～85（56.37±11.40）岁。纳入标准：①符合中国2型糖尿病防治指南（2017年版）中2型糖尿病的诊断标准[6]；②知情同意参与本次研究。排除标准：①并发自身免疫性疾病、恶性肿瘤、泌尿系统感染及其他肾脏疾病者；②服用影响尿清蛋白排泄及肾功能的药物。根据尿清蛋白/尿肌酐(urinary albumin /creatinine, UACR)比值，将162例2型糖尿病患者分为单纯2型糖尿病组（正常清蛋白尿）54例（UACR＜30mg/g）和108例DN组（UACR≥30mg/g）；108例DN患者分为微量清蛋白尿组50例（UACR 30～300mg/g）和大量清蛋白尿组58例（UACR＞300mg/g）。另选取健康体检正常者50例作为对照组，其中男性30例，女性20例，年龄40～83(58.15±8.72)岁。

1.2 仪器与试剂 7500型荧光定量PCR仪（ABI公 司），PCR试 剂 盒，RNeasy试 剂 盒，miRNA Easy试剂盒和Trizol试剂盒由上海生物工程有限公司提供。日立7600型全自动生化仪及配套试剂。

1.3 方法

1.3.1 miR-188-5p及miR-379-5p检测：所有患者均于确诊当日采集静脉血5 ml并离心分离血清，在ABI 7500型荧光定量PCR仪上检测miR-188-5p及miR-379-5p。逆转录反应体系15μl（5μl RNA模板，3μl U6及miRNA特异性茎环引物，0.15μl 100mmol/L脱氧核糖核苷酸，1.00μl逆转录酶，1.50μl10×反转录缓冲液，0.19μl RNase抑制剂，4.16μl双蒸水）。PCR总反应体系为20μl：1μl引物及探针Mix（20×），10μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μl反向转录脱氧核糖核酸，7.67μl双蒸馏水。采用2-△Ct法计算miR-188-5p及miR-379-5p水平。

1.3.2 生化指标检测: 使用日立7600型全自动生化仪及配套试剂检测尿微量清蛋白（mALB）、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbAlc）、血肌酐（sCr）和尿素氮（BUN）。

1.4 统计学分析 采用SPSS20.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；两组比较采用t检验。计数资料比较采用χ2检验。应用多因素Logistic回归分析影响DN发生的危险因素。绘制受试者工作特征（ROC）曲线分析miR-188-5p，miR-379-5p及mALB水平诊断DN的价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组临床一般资料比较 见表1。DN组和2型糖尿病组HbAlc及FBG水平与对照组比较，差异均有统计学意义（t=6.815, 8.214; 6.217, 7.983, 均P＜0.05）。DN组 病 程、sCr，BUN，UACR及mALB均明显高于2型糖尿病组，差异有统计学意义（t=5.782, 5.260, 5.184, 13.548, 12.163, 均P＜0.05）。

表1 各组临床一般资料比较[（±s），n（%）]

表1 各组临床一般资料比较[（±s），n（%）]

项目 对照组（n=50） 2型糖尿病组（n=54） DN组（n=108） χ2/F值 P值男性 30（60.0） 29（53.7） 66（61.1） 0.619 0.447年龄（岁） 58.15±8.72 55.48±10.96 57.10±12.35 1.904 0.195病程（年） - 7.80±4.18 11.75±6.30 7.151 0.000体质指数(kg/m2) 23.82±2.54 24.15±2.73 24.53±2.81 0.602 0.593 HbAlc(%) 4.58±0.83 8.16±1.65 8.75±1.84 9.973 0.000 FBG(mmol/L) 5.06±0.58 9.17±2.72 10.05±3.26 8.417 0.000 sCr (μmol/L) 69.20±11.37 72.14±12.90 145.81±55.37 7.105 0.000 BUN(mmol/L) 5.24±1.13 5.68±1.25 9.22±3.46 6.528 0.000 UACR（mg/g） - 16.38±5.92 483.25±106.37 18.850 0.000 mALB (mg/L) 7.52±2.46 8.63±3.05 147.62±51.30 16.712 0.000

2.2 DN组、2型糖尿病组和对照组血清miR-188-5p及miR-379-5p水平比较 见表2。DN组血清miR-188-5p及miR-379-5p水平均明显低于2型糖尿病组和对照组（t=10.316, 14.517; 13.805, 16.218,均P＜0.05），且2型糖尿病组血清miR-188-5p及miR-379-5p水平均明显低于对照组，差异有统计学意义（t=9.425, 10.738，均P＜0.05）。

表2 DN组、2型糖尿病组和对照组血清miR-188-5p及miR-379-5p水平比较（±s）

表2 DN组、2型糖尿病组和对照组血清miR-188-5p及miR-379-5p水平比较（±s）

项目 对照组（n=50） 2型糖尿病组（n=54） DN组（n=108） F值 P值miR-188-5p 1.06±0.35 0.71±0.20 0.20±0.08 16.813 0.000 miR-379-5p 1.84±0.71 1.15±0.35 0.57±0.16 19.516 0.000

2.3 不同清蛋白尿组血清miR-188-5p及miR-379-5p水平比较 大量清蛋白尿组血清miR-188-5p（0.06±0.01）及miR-379-5p（0.24±0.10）水平均明显低于微量清蛋白尿组（0.47±0.13, 0.98±0.25），差异有统计学意义（t=10.926, 12.714, 均P＜0.05）。

2.4 多因素Logistic回归分析2型糖尿病患者发生DN的危险因素 见表3。以2型糖尿病患者是否发生DN为因变量，将差异有统计学意义的变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示病程、sCr，BUN，UACR，mALB，miR-188-5p及miR-379-5p是影响2型糖尿病患者发生DN的独立危险因素（均P＜0.05）。

表3 多因素Logistic回归分析2型糖尿病患者发生DN的危险因素

2.5 miR-188-5p，miR-379-5p及mALB水 平诊 断DN的价值见表4，图1。miR-188-5p，miR-379-5p及mALB水平诊断DN的最佳截值分别为0.46，0.85，82.40 mg/L，三项联合诊断DN的曲线下面积明显高于miR-188-5p，miR-379-5p及mALB单项检测，差异有统计学意义（P＜0.05），其敏感度和特异度分别为97.4%和85.3%。

图1 miR-188-5p，miR-379-5p水平诊断DN的ROC曲线

表5 miR-188-5p，miR-379-5p及mALB水平诊断DN的价值

3 讨论

糖尿病肾病（DN）的发生发展与免疫炎症反应、氧化应激、代谢异常以及表观遗传学有关，其中表观遗传学在DN中发病机制是当前研究的热点[7]。miRNA作为一类非编码的小分子RNA，通过参与细胞基因表达的调节而影响生物体的各项生命活动，在DN的发生发展中发挥重要的作用，有望成为DN诊断的潜在标志物以及药物治疗的新靶点[8]。既往研究表明，miRNA通过影响多条信号通路中多种信号分子的表达参与DN的发病过程，与DN患者的肾功能损伤、间质纤维化和足细胞凋亡有关，可能为了解DN的发病机制提供新思路[9-10]。mALB是评估肾功能损害的重要指标，其与DN的发病关系密切[11]。

本研究显示，DN组血清miR-188-5p，miR-379-5p水平均明显低于2型糖尿病组和对照组，且2型糖尿病组明显低于对照组，提示miR-188-5p及miR-379-5p低表达可能参与DN的发生。本研究中大量清蛋白尿组血清miR-188-5p及miR-379-5p水平均明显低于微量清蛋白尿组，提示miR-188-5p及miR-379-5p低表达有利于促进DN患者的病情进展。MA等[12]研究表明，miRNA调节多种生物细胞功能，miRNA的表达改变与DN发生密切相关，可能是预测DN发生的独立因子。YU等[13]研究认为，miRNA可能通过促进肾脏纤维化、新生血管形成等途径参与DN的发生和发展，可作为诊断DN的无创生物学指标。本研究多因素Logistic回归分析显示，miR-188-5p及miR-379-5p是影响2型糖尿病患者发生DN的重要危险因素。提示2型糖尿病患者血清miR-188-5p及miR-379-5p水平降低，其发生DN的风险较高。mALB是早期诊断肾小球微血管病变的有效指标，mALB水平升高可促进DN的发生发展，是预测DN发生的危险因子[14]。此外，病程，sCr，BUN及UACR也是影响DN发生的危险因素，这可能使糖尿病病程延长导致DN的发病风险增加，长期的高sCr，BUN及UACR不仅会造成肾小球硬化，还会使肾小管上皮细胞转化成肌纤维细胞，进而导致肾功能损伤。

本研究应用ROC曲线分析显示，miR-188-5p及miR-379-5p联合mALB诊断DN的曲线下面积（0.952，95%CI：0.890～0.997）最大，其敏感度和特异度分别为97.4%和85.3%。说明miR-188-5p，miR-379-5p及mALB三项联合检测对DN诊断的效能较好，miR-188-5p及miR-379-5p有望成为DN诊断的新型生物标志物。陈燕等[15]研究显示，DN患者尿mALB水平明显升高，尿mALB是早期DN发病的独立危险因素，可协助早期DN的诊断,具有一定的临床价值。GHOLAMINEJAD等[16]研究发现，与对照组相比，DN患者中miRNA表达失调，且其低表达参与DN的病情进展，在DN发生发展中起着重要作用，可能是DN患者的一个非侵入性的潜在生物标志物。

综上所述，DN患者血清miR-188-5p及miR-379-5p水平明显降低，是影响2型糖尿病患者发生DN的独立危险因素，联合mALB在DN诊断中具有较好的价值。