王胜洁,魏子奇,曹 慧,徐 斐,叶 泰,袁 敏,吴秀秀,阴凤琴,于劲松,郝丽玲

(上海理工大学 健康科学与工程学院,上海食品快速检测工程技术研究中心,上海 200093)

在农业领域,农药主要用于抑制农作物中虫类生长繁殖和预防病虫害[1],但残留在水果、蔬菜和粮食作物以及水、土壤等环境中的农药,会通过食物链不断在人体内累积,从而致畸、致癌、致突变等,严重影响了人们的日常食用安全。为此,国家制定了严格的限量和检测标准,以对食品中的农药残留量进行控制。目前,检测农药常用的方法为色谱法,主要包括气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法[2-4]等。这些方法虽然具有较高的灵敏度,但需要熟练的技术人员、复杂的样品制备过程及昂贵的仪器设备,因此有必要开发出新的农药快速检测技术。

分子印迹聚合物(MIP)具有高度选择性、特异识别性,可以从复杂食品中富集痕量目标物[5],还具有耐高温高压、耐酸碱、不易被破坏且能重复使用等优良特性[6]。MIP 对目标物的专一性识别能够有效解决传统农药残留检测方法存在的特异性差、受反应物质干扰大等问题,已被广泛应用于待测样品中目标物的选择性富集,但并不能实现同步检测。目前已经发展出多种印迹聚合物的标记检测技术,在这些技术中,量子点荧光探针技术因具有快速、灵敏、简便的特点而受到广泛关注。将不同粒径的荧光量子点修饰于材料中,还可在同一激发光下实现对目标物的同步检测[7]。

将分子印迹技术与量子点修饰技术结合形成针对农药分子的印迹荧光探针,即可通过探针的荧光猝灭或增强判断农药的含量变化。该方法具有抗干扰能力强、选择性高等优点,对农药残留检测具有独特优势,可以实现对目标物的高灵敏快速检测。因此,本工作首先对分子印迹技术的原理、制备方法及应用进行概述,在此基础上,进一步阐述了量子点修饰的分子印迹荧光探针在农药检测中的应用和展望。

1 MIP的合成原理及制备方法

1.1 MIP的合成原理

分子印迹技术是模拟天然抗原和抗体特异性识别的机制[8],通过合成特定的MIP对目标模板进行选择性识别。由于其具有人工合成的识别位点,即使在存在结构类似物的情况下也能够重新结合目标分析物。MIP 的合成步骤如图1 所示,主要分为3个步骤:功能单体和模板分子在一定比例下,通过合适的条件,以共价键或非共价键作用方式发生预聚合反应,形成预聚合物;预聚合物与致孔剂、交联剂在热或者光作用下发生聚合反应;反应结束后利用合适的洗脱剂去除模板,从而形成与目标物大小、形状、结构相匹配的空穴。当存在目标模板时,制备好的MIP内部功能基团与其特异结合,充分发挥MIP的特异识别功能[9-10]。

图1 MIP的制备过程Fig.1 Preparation process of MIP

在MIP的制备过程中,模板分子与功能单体形成的预聚合体系对所制备的高分子聚合物的吸附性能和识别性能起着重要的作用[11]。因此,很多研究者在制备印迹聚合物前,首先采用紫外-可见分光光度法、等温滴定量热法、计算机模拟方法[12]、红外-可见分光光度法[13]、核磁共振法[14]等筛选出相应的功能单体。目前,已成功制备的MIP中的农药模板分子大多数含有硝基亚甲基(C＝CHNO2)、硝基胍(C＝NO2)和氰基脒(C＝NCN)等功能基团,还含有6-氯-3-吡啶(吡虫啉)、2-氯-5-噻唑(噻虫嗪)和四氢呋喃环(呋虫胺)等活性基团。筛选出的功能单体多为3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、苯基硅烷、丙烯酸、甲基丙烯酸等。这些功能单体和农药模板分子之间可以通过氢键、π-π键等稳定价键结合,形成更稳定的分子复合体系。

表1总结了农药模板与常用功能单体的作用方式及合成MIP的检测应用。

表1 农药模板与常用功能单体的作用方式及合成MIP的检测应用Tab.1 Action modes of templates of pesticides and common functional monomers and detection applications of synthetic MIP

1.2 MIP的制备方法

1.2.1 本体聚合法

本体聚合法指将模板分子、功能单体、交联剂等按一定比例在溶剂中混合,去除氧后,加入合适的交联剂或引发剂,通过加热或者光引发聚合。这种制备方法操作较为简便,但合成的刚性聚合物需要进一步研磨和筛分,可能会破坏聚合物的结构和印迹位点。而且采用此法制备的印迹聚合物的印迹位点被深深包埋在聚合物内部,不利于模板的洗脱和待测物质的吸附,导致传质速率慢,结合能力差[28]。ARIA 等[29]以吡虫啉为模板,乙酰乙酸甲酯(MAA)为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂,在模板、功能单体、交联剂的物质的量比为1∶4∶20时,制备了吡虫啉MIP。将MIP、非分子印迹聚合物(NIP)和固相萃取相结合,对土壤和番茄中吡虫啉农药进行提取,印迹因子(评价MIP好坏的指标之一,印迹因子越大,说明其印迹效果越好)分别为21,17。

1.2.2 电化学聚合法

电化学聚合法采用电化学方法使模板分子、功能单体、交联剂等在电极表面发生电聚合反应,直接形成MIP膜,再利用洗脱剂洗脱模板分子,得到电聚合分子印迹电极。采用电化学聚合法制备的分子印迹膜具有均匀、稳定,形成的分子印迹腔结构不易变形等优点,因而以其为敏感元件构建的印迹传感器具有良好的选择性和较高的灵敏性。但是,分子印迹电化学聚合法还具有一定的局限性,包括结构易碎、在不同溶剂中溶解度有限、检测过程中选择性较差等[30]。ZHANG 等[31]开发了一种偶联MIP的比率电化学传感器。首先通过Au-S键将6-(二茂铁基)己硫醇(Fc HT)自组装到修饰金纳米颗粒(Au NPs)的玻碳电极(GCE)上,再将功能单体邻苯二胺(OPD)和模板分子吡虫啉电聚合在传感器表面形成分子印迹层,并将其应用于吡虫啉的检测。该法对吡虫啉农药检出限为4.7×10－8mol·L－1,对实际样品梨和橘子中吡虫啉农药的回收率为97.0%～103.2%。

1.2.3 沉淀聚合法

沉淀聚合法是将分子印迹层沉积到固体基质表面上的一种手段。相对于本体聚合法,沉淀聚合法有如下优势:制备的印迹聚合物不需要研磨过筛、洗脱模板分子相对容易、制备的过程中不需要表面活性剂。LI等[32]采用溶胶-凝胶法制备出二氧化硅载体,再以氰戊菊酯为模板,丙烯酰胺为功能单体,通过沉淀聚合法在其上合成SiO2-TiO2＠Ag＠MIPs。该聚合物对氰戊菊酯农药的吸附量达到24.1 mg·g－1,检测线性范围为1.0～100 nmol·L－1,检出限达到0.2 nmol·L－1。

1.2.4 乳液聚合法

乳液聚合法是将交联剂、功能单体与模板混合,并经剧烈搅拌或超声处理使其在含有表面活性剂的水相中乳化。与经过研磨和筛分的材料相比,由乳液聚合法制得的印迹聚合物可改善结合位点表面的均质性。但是,乳液聚合法仍存在不足,通常需要使用大量化学物质,如表面活性剂、缓冲溶液和稳定剂等,这些化学物质在合成印迹聚合物后必须去除,从而会使洗脱过程变得复杂[33]。反相微乳液法是最常见的乳液聚合法,GHANI等[34]基于聚合物量子点(PQDs)和碳量子点(CQDs),采用反相微乳液法分别制备了两种不同的分子印迹荧光传感器(PQDs＠MIP和CQDs＠MIP),并应用于啶虫脒农药的检测。结果发现,PQDs＠MIP 具有更宽的检测范围,在0.08～109 nmol·L－1内具有良好的线性关系,检出限低至0.02 nmol·L－1,可应用于水和苹果中啶虫脒的检测。

2 荧光量子点

MIP一般应用于对目标分子的吸附和富集,但不能实现对其同步快速检测。近年来,很多研究者采用不同的标记物标记制备好的MIP,并将其应用于目标物的选择性富集和快速检测。与其他荧光团、有机染料相比,量子点因具有出色且独特的光学特性、较高的荧光量子产率等优点[35],已被广泛应用于痕量物质的检测中。量子点的感应机制取决于其发光灵敏度,大多数荧光猝灭或恢复原理是目标分析物与量子点荧光团之间存在化学或物理相互作用[36]。表2总结了近年来量子点在不同农药检测中的应用,其中GQDs为石墨烯量子点。

表2 量子点在不同农药检测中的应用Tab.2 Application of quantum dots in detection of different pesticides

2.1 碳量子点

近些年,CQDs作为有毒量子点的环保替代品,引发人们的极大关注[42]。CQDs的主要优点包括无毒、高光稳定性、低成本和高表面钝化性能等,其他有利特性包括出色的生物相容性、化学惰性和高比表面积[43],因此将CQDs作为响应信号可以对不同的农药进行检测。CQDs荧光传感器的设计分为3种[44]:CQDs纳米颗粒直接与目标物发生反应,并导致CQDs荧光信号发生变化;CQDs与特定受体结合后功能化,以构建荧光纳米传感器;将CQDs与荧光团、底物和猝灭剂结合在一起。表3总结了近几年CQDs在不同农药检测中的应用。AMJADI等[45]设计了一种双发射介孔结构的分子印迹荧光传感器,对三唑醇类杀虫剂进行检测。以APTES、硅酸乙酯、十六烷基三甲基溴化铵、NH3·H2O 作为反应原料,通过溶胶-凝胶法制备m MIP＠CD/QDs纳米颗粒,其中CQDs作为参比信号包裹在二氧化硅核内,Cd Te/CdSQDs提供检测信号。此传感器的线性范围为20～160μg·L－1,检出限为6.4μg·L－1,用于河水和废水样品中杀虫剂的检测。

表3 CQDs在不同农药检测中的应用Tab.3 Application of CQDs in detection of different pesticides

2.2 硅量子点

硅量子点(SiQDs)由于具有良好的水溶性、独特的光学特性和较高的生物相容性,被广泛开发用于制备高性能荧光传感器。与Cd Te和CdS等重金属半导体量子点相比,SiQDs具有更窄的光谱线宽以及易于制备、环保、高灵敏度等优良特性[52-53],常作为荧光传感器的检测信号。YI等[54]以新型的SiQDs为基础制备荧光传感器,用于对农药的超灵敏检测,检测原理是乙酰胆碱氯化物(ACh)与乙酰胆碱酯酶(AChE)反应形成胆碱,胆碱氧化酶(Ch Ox)催化氧化胆碱生成过氧化氢,导致SiQDs的荧光猝灭。加入农药后,AChE 的活性受到抑制,导致生成的过氧化氢减少,因此SiQDs的荧光强度升高,抑制效率与农药质量浓度的对数呈线性相关。使用SiQDs荧光方法测定甲萘威、对硫磷、二嗪农和甲拌磷,测定下限分别为7.25×10－9,3.25×10－8,6.76×10－8,1.9×10－7g·L－1。

2.3 修饰不同配体的量子点

配体在量子点的合成及其光学性质的调节中起主要作用,在量子点的合成过程中,配体可以确保胶体稳定,同时可控制形成具有单分散尺寸的纳米颗粒。配体在量子点表面的修饰还能增加其稳定性并降低生物毒性[55]。多种类型的材料,如巯基乙酸(TGA)[56]、3-巯基丙酸(3-MPA)[57]和生物聚合物材料[58]等已被用于量子点的修饰中。表4总结了近几年不同配体修饰的量子点在农药检测中的应用。GUO 等[59]用TGA 修饰带负电的Cd Te量子点(TGA-Cd Te-QDs),用半胱胺稳定带正电的金纳米颗粒(CS-Au NPs),并通过二者之间的荧光共振能量转移检测草甘膦。由于静电相互作用,带相反电荷的TGA-Cd Te-QDs和CS-Au NPs可以形成荧光能量共振转移供体-受体组件,从而有效地猝灭TGA-Cd Te-QDs的荧光强度。当存在草甘膦时,通过静电相互作用诱导CS-Au NPs聚集,从而导致猝灭量子点的荧光恢复。该方法已用于苹果中草甘膦的检测,线性范围为0.02～2.0μg·kg－1,检出限为9.8 ng·kg－1。

表4 不同配体修饰的量子点在不同农药检测中的应用Tab.4 Application of quantum dots modified with different ligands in detection of different pesticides

3 基于荧光量子点探针的分子印迹技术在农药检测中的应用

随着科学技术的发展,农药的种类也随之增多,常使用的农药有拟除虫菊酯类农药、有机磷农药、新烟碱类农药等。这些农药在农业中广泛应用,在食品安全检测中一直被人们高度关注[65]。为了改善基于量子点荧光传感器的选择性识别,分子印迹技术已作为一种常见的方法引入到识别单元中[66]。将量子点和MIP 相结合,能够明显改善MIP 对目标物的吸附量,并提高聚合物对目标物的特异性识别功能和传质速率,分子印迹荧光传感器在分子识别领域中发挥着重要作用[67]。

3.1 在有机磷农药检测中的应用

有机磷农药占全球化学农药市场的34%以上,并在疾病和害虫的预防和控制中发挥积极作用[68]。有机磷农药由于显示出较低的生物蓄积性、快速的生物降解、高毒性和广泛的目标范围,被广泛用于农业中,以防治寄生虫、保护农作物[69-70]。然而,由于较长的半衰期和使用方法的不当,有机磷农药的残留物会对农产品、环境和水系统造成严重污染[71],因此加强对有机磷农药的检测尤为重要。

TANG 等[72]将对硫磷作为模板分子,APTES和四甲氧基硅烷作为功能单体,Cd Te量子点作为检测信号,通过反相微乳液聚合反应制备了具有分子识别活性的表面分子印迹荧光纳米粒子。该聚合物对对硫磷的线性范围为0.05～1 000μmol·L－1,检出限为0.218μmol·L－1,水样中对硫磷的回收率为97.7%～100.59%。LI等[73]开发了一种新型的分子印迹荧光传感器,用于乐果的检测。随着乐果浓度的增高,荧光猝灭效果增强,即二者之间发生了荧光共振能量转移。在最佳条件下,乐果的浓度在6×10－10～3.4×10－8mol·L－1内可获得良好的线性相关,检出限为1.83×10－10mol·L－1。该传感器具有灵敏度高、线性范围宽、检出限低、使用方便等特点,已成功用于测定实际样品中乐果的含量。

3.2 在拟除虫菊酯类农药检测中的应用

拟除虫菊酯类农药作为一种商业杀虫剂,具有毒性低、稳定性好和对害虫具有广谱抗性等优点,在农业使用中越来越广泛[3]。残留在水果和蔬菜中的拟除虫菊酯类农药,在进入人体后会影响中枢神经系统,继而引起意识障碍和癫痫的发作,并且也会使内分泌紊乱,严重影响了人们的日常食品安全。因此,加强对拟除虫菊酯类农药的检测十分有必要。LI等[74]采用反相微乳液法合成CdSe＠SiO2＠MIP,并应用于水中痕量λ-氟氰菊酯的检测。结果表明,λ-氟氰菊酯浓度在0.1～1 000μmol·L－1内,CdSe＠SiO2＠MIP 的相对荧光强度随农药浓度的增加呈线性下降的趋势,检出限低至3.6μg·L－1。表5总结了拟除虫菊酯类农药模板与常用功能单体的作用方式及合成MIP的检测应用。

表5 拟除虫菊酯类农药模板与常用功能单体的作用方式及合成MIP的检测应用Tab.5 Action modes of templates of pyrethroid pesticides and common functional monomer and detection applications of synthetic MIP

3.3 在新烟碱类农药检测中的应用

新烟碱类农药在烟碱结构的基础上修饰而得,包括吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉、呋虫胺等。新烟碱类农药由于具有低毒、高效、低残留等优点,被广泛用于抑制农作物中虫类的生长繁殖,但其残留会给人类及生态环境造成威胁,因此有必要加强对农副产品中、环境中新烟碱类农药的残留检测。量子点与分子印迹技术相结合,已被广泛应用于痕量物质的检测中,将其制备成荧光传感器,不仅可以提高荧光探针的选择性,还可以同时测定几种不同的物质。

LIU 等[79]开发出一种基于分子印迹荧光的噻虫啉快速检测试纸条。首先将氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)浸入滤纸中,再将具有噻虫啉的多巴胺在试纸条表面上自聚合,以形成均匀的聚多巴胺膜(PDA)。除去噻虫啉模板后,合成的PDA＠MIP可以选择性地识别噻虫啉。结果显示,噻虫啉的质量浓度为0.1～10 mg·L－1时,与N-GQDs的荧光猝灭程度呈线性相关,检出限低至0.03 mg·L－1。MARZIYE等[80]通过溶胶-凝胶法在硅碳量子点(Si-CDs)表面形成印迹层,并将合成的光传感器用于啶虫脒的选择性检测。结果表明,啶虫脒农药的线性范围为7～107 nmol·L－1,检出限达到2 nmol·L－1,印迹因子为9.8,该荧光 传感器(MIP＠Si-CDs)已成功用于实际样品水和苹果中啶虫脒的定量分析中。

4 结论与展望

将量子点修饰技术和分子印迹技术相结合制备的新型荧光传感器,不仅可以高特异性、高选择性地识别目标分子,还可以提高检测的灵敏度。目前,分子印迹荧光传感器已广泛应用于食品与农业等领域,起到了保障食品安全、保护生态环境等作用。但不足的是,由于农药的多样性导致其在分子印迹应用方面往往只能针对一个类别的农药,不具广谱性;另外在分子印迹的应用及量子点的开发中产生较多不确定性,如制备过程中有效去除模板分子技术还不成熟,性能优异的荧光团在分子印迹荧光传感器中的应用有待提高。