吴倩倩,马丽霞,刘 阳,董 浩,王宪朋

(山东省药学科学院,山东省医用高分子材料重点实验室,济南 250100)

缓释制剂通过溶解或分散的形式将药物包含于载体基质中,药物作用于人体后可在较长时间内缓慢稳定释放,达到提高疗效和患者耐受性、减少不良反应等效果。目前长效缓释微球制剂大多以生物可降解聚合物为载体,具有靶向性,药物稳定性高、缓释周期长,其缓释对象以多肽、蛋白类及部分小分子化学药物为主,临床上多用于治疗肿瘤、精神障碍、退化性病变等疾病,成为国内外学者和制剂研发人员的研究热点。

丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)作为一种药用辅料早已被收录到«中华人民共和国药典»,由于具有良好的可降解性和生物相容性,且对人体无毒,常被用于缓释制剂载体[1-3]。目前较多研究者将研究重点放在缓释制剂的制备工艺上[4-8],而对于聚合物合成过程中可能残留的单体含量却没有探讨。当PLGA作为药物缓释制剂载体时,单体残留量太大会加快载体的降解速率,进而影响药物的缓释效果。此外,某些药物会与残留单体上的基团发生相互作用,形成杂质,影响制剂质量。为此,本课题组在前期研究中制备了低残留缓释制剂载体PLGA50/50[9]。

目前多采用直接进样-气相色谱法测定聚合物中单体的残留量[10-13],该方法得到的样品溶液含有一定量的聚合物,在测定时一同进入系统,对进样系统造成污染,同时聚合物在测定过程中可能受氢火焰影响而发生分解,使得单体峰出现不同程度拖尾,尤其当聚合物中单体残留量较小时,拖尾现象对测定结果的影响尤为显著,因此此方法不适用于PLGA 中单体残留量的测定。此外,还有研究者采用萃取等方式处理样品[14-15],也存在操作复杂、回收率不高等不足。文献[16]采用溶解沉淀法处理样品,但是研究还不够深入,存在沉淀剂制备较复杂、回收率较低等不足。

为了解决上述问题,准确、方便地测定PLGA单体残留量,本工作利用聚合物和单体在有机溶剂中的溶解度差异,采用溶解沉淀法,有效降低直接进样法所带来的系统污染,也大幅提高了检测准确度,提出了一种适用于低残留PLGA 中单体残留量测定的气相色谱法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 6890N 型气相色谱仪,配氢火焰离子化检测器(FID);BS224S 型电子分析天平(感量0.000 1 g)。

混合标准储备溶液:1.000 g·L－1,精密称取丙交酯(DL-LA)和乙交酯(GA)各0.1 g,加二氯甲烷溶解并定容至10 mL,摇匀。取上述溶液1 mL 置于10 mL 容量瓶中,用二氯甲烷定容,配制成质量浓度为1.000 g·L－1的混合标准储备溶液。

混合对照品溶液:0.050 g·L－1,移取混合标准储备溶液0.50 mL,置于10 mL容量瓶中,用二氯甲烷稀释至刻度,摇匀,配制成质量浓度为0.050 g·L－1的混合对照品溶液。

混合对照品溶液系列:移取混合标准储备溶液0.05,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60 mL,分别置 于10 mL容量瓶中,用二氯甲烷稀释至刻度,摇匀,配制成质量浓度分别为0.005,0.010,0.020,0.030,0.040,0.050,0.060 g·L－1的混合对照品溶液系列。

DL-LA、GA 的质量分数均不小于99.5%;正己烷、二氯甲烷均为分析纯。

用于前期研究的高残留样品PLGA50/50 1批,批号18080802,质量分数不小于99.5%;用于回收率测定的低残留样品PLGA50/50 1 批,批号18101909,质量分数不小于99.5%;用于测定单体含量或重复性的低残留样品PLGA50/50 3批,批号分别为19021301、19021401、19021801,质量分数不小于99.5%。

1.2 色谱条件

Agilent HP-INNOWax毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);进样口温度250 ℃,柱 温160 ℃,检测器温度300 ℃;载气为高纯氮气,流量8 mL·min－1;分流比10∶1;进样量3μL。

1.3 试验方法

精密称取样品约0.1 g,加7 mL 二氯甲烷(溶剂)溶解后,置于10 mL 容量瓶中[16],加正己烷(沉淀剂)稀释至刻度,摇匀,置于离心管中,以转速3 000 r·min－1离心10 min,取上清液作为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 系统适应性

取空白溶剂二氯甲烷与混合对照品溶液,分别注入气相色谱仪,按照1.2节色谱条件测定,记录色谱图。空白溶剂与混合对照品溶液的色谱图见图1。

图1 典型气相色谱图Fig.1 Typical gas chromatograms

由图1可知,在此条件下,GA 和DL-LA 得到有效分离,且空白溶剂对两种单体的测定无干扰。

混合对照品溶液中GA 和DL-LA 之间的分离度及理论塔板数如表1所示。

表1 单体残留量系统适用性试验数据Tab.1 Data of test for system suitability of monomer residue

由表1可知,两种单体分离度均大于1.5,理论塔板数均大于10 000,系统适用性满足要求。

2.2 前处理方法的选择

在前期的工作中发现,传统的高残留样品(批号为18080802)直接用二氯甲烷溶解后进样时,因受到溶解的聚合物的影响而出现明显的拖尾现象。这不仅会干扰测定结果,还会污染衬管。因此,尝试采用溶解沉淀法,减少测定溶液中的聚合物,降低对测定结果的影响。如图2所示,样品采用溶解沉淀法后,单体峰拖尾现象显著改善(两种单体峰中间的峰是样品中的不明杂质,不影响两种单体的含量测定)。

图2 直接进样法和溶解沉淀法的气相色谱图Fig.2 Gas chromatograms by direct injection method and dissolving-precipitation method

用溶解沉淀法处理样品后,不仅单体峰的拖尾现象可以明显改善,而且经过反复试验,系统也不会再受到样品的污染,多次试验后衬管依然洁净。因此,试验采用溶解沉淀法进行前处理。

2.3 溶剂和沉淀剂体积比的选择

经过研究发现,样品处理过程中,沉淀剂比例越高,单体峰的拖尾越不明显,但是单体回收率会越低。为了保证在回收率合格的情况下得到准确的测定结果,试验考察了不同体积比的溶剂(二氯甲烷)和沉淀剂(正己烷)对单体回收率的影响,结果见表2。

表2 溶剂和沉淀剂体积比对单体回收率的影响Tab.2 Effect of volume ratio of solvent to precipitant on monomer recovery

由表2可知,当溶剂与沉淀剂的体积比为7∶3时,即样品用7 mL二氯甲烷溶解后再加3 mL正己烷进行沉淀时,测得的回收率满足«中华人民共和国药典»要求(92.0%～108%)。因此,试验选择溶剂与沉淀剂的体积比为7∶3。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

取混合对照品溶液系列注入气相色谱仪,按照1.2节色谱条件进行测定。以单体的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。所得线性回归方程、线性范围、相关系数见表3。

分别移取混合标准储备溶液适量,加二氯甲烷逐级稀释,按照1.2 节色谱条件分别进样测定,以3倍信噪比(S/N)对应的质量浓度为检出限(3S/N),以10 倍信噪比对应的质量浓度为测定下限(10S/N),结果见表3。

表3 线性参数、检出限和测定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度试验

2.5.1 仪器精密度

取混合对照品溶液,按照1.2节色谱条件平行测定6次。结果表明,GA 和DL-LA 两种单体6次测定峰面积的平均值分别为76.18,17.58,峰面积测定值的相对标准偏差(RSD)分别为1.3%,0.85%。说明仪器精密度满足测定要求。

2.5.2 重复性试验

取PLGA50/50(批号为19021401),按照1.3节试验方法配制6份供试品溶液,按照1.2节色谱条件测定。结果表明,供试品溶液中GA 和DL-LA 的残留量分别为0.042 5%,0.036 4%,测定值的RSD分别为2.9%,2.5%,均小于3.0%,说明方法满足重复性要求。

2.6 回收试验

精密移取混合标准储备溶液0.50 mL,置于10 mL容量瓶中,加6.5 mL 二氯甲烷后再用正己烷定容,摇匀,作为100%回收率对照品溶液(用于测定加标量)。

精密称取样品约0.1 g,加入6.5 mL二氯甲烷溶解样品,转移至10 mL容量瓶中,然后加入混合标准储备溶液0.5 mL,用正己烷稀释至刻度,摇匀,置于离心管中,以转速3 000 r·min－1离心10 min,取上清液作为100%回收率样品溶液,平行制备6份。

精密称取样品约0.1 g,加入7 mL 二氯甲烷溶解样品,转移至10 mL 容量瓶中,并用正己烷稀释至刻度,摇匀,置于离心管中,以转速3 000 r·min－1离心10 min,取上清液作为样品溶液(用于测定本底值),并平行制备3份。

按照1.2节色谱条件分别测定100%回收率对照品溶液、100%回收率样品溶液和样品溶液的峰面积,两种单体的回收率结果如表4所示。

表4 回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of test for recovery(n＝6)

由表4 可知,DL-LA 的回收率为101%,RSD为1.2%,GA 的回收率为97.0%,RSD 为1.5%。

2.7 样品分析

取3 批样品,按照试验方法进行测定,结果见表5。

表5 样品分析结果Tab.5 Analytical results of the samples

由表5可知,各批样品中两种单体残留量均小于0.050%。3批样品的气相色谱图如图3所示。

图3 3批样品的色谱图Fig.3 Gas chromatograms of three batches of samples

本工作以二氯甲烷为溶剂,正己烷为沉淀剂,并用离心的方法得到供试品溶液,采用气相色谱法测定低残留PLGA 中DL-LA 和GA 两种单体的残留量。方法精密度高、回收率高,单体质量浓度在相应的线性范围内与峰面积具有良好的线性关系,溶解沉淀法有效降低了直接进样法所带来的系统污染,也大幅提高了检测准确度,对于低残留PLGA 的质量控制和缓释制剂载体的研究开发具有重要意义。