朱静坚 ,伍春桃 ,周玉磊 ,杨惠宁 ,田 薇∗

(1.缙云县农业农村局,丽水 323000;2.浙江农林大学,杭州 310000)

白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)具有抗氧化、抗肿瘤、保护肝脏和调节人体免疫力的临床活性,在癌症、糖尿病、肝炎、免疫缺陷等疾病的防治中起着重要的作用[1]。由于自然环境和人为因素对白术药物中活性成分影响显著,白术药材质量存在着巨大差异,因此迫切需要制定严格的白术质量控制标准。以往的研究主要集中在白术中的小分子化合物上,如黄酮类、萜类和挥发性成分的质量评价体系的建立等。多糖也是白术中的主要成分[2],具有一定的抗氧化活性,而由于白术中多糖组成成分复杂,其提取分离方法和在质量控制方面的研究报道较少,且相关研究进展缓慢,严重制约了白术多糖质量的评价和功能性多糖产品的商业化开发[3]。

目前,药用植物中多糖质量评价的报道很少,涉及的药材仅有黄芪[4]、灵芝[5]、藏红花[6],主要采用指纹图谱及其抗氧化活性建立多糖质量的评价体系。同时,多糖抗氧化活性的作用机制尚不明确,已有的研究表明:含有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的酸性多糖中存在醛、酮等亲电基团,有利于氢从O－H键中释放出来,对多糖抗氧化活性的贡献较大[7];多糖的抗氧化活性与鼠李糖、甘露糖和半乳糖具有正相关关系[8],与葡萄糖呈显著负相关关系,与半乳糖不相关[9]。另外,由于多糖的组成、结构和检测方法的复杂性,长期以来将其作为大多数植物的药用活性成分并没有得到重视[10]。复杂的组成和结构导致了不同来源药材中多糖的种类和含量的差异,因此可筛选出特征多糖,使其成为潜在的化学标记物[11-12]。基于此,本工作采用高效液相色谱法(HPLC)采集指纹图谱,以白术多糖抗氧化活性与化学计量学相结合的方法,探讨白术多糖的潜在化学标记物,为建立不同产地白术多糖的有效评价体系奠定基础。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 2695系列高效液相色谱系统,配紫外检测器;DZF-6020型真空干燥箱;UV-2100型紫外分光光度计。

单糖混合对照品溶液:0.45 g·L－1,准确称取适量的鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖对照品,用水溶解稀释,配制成质量浓度均为0.45 g·L－1的单糖混合对照品溶液。

葡萄糖标准溶液:1.00 g·L－1,准确称取10 mg无水葡萄糖,用水溶解并定容至10 mL,配制成质量浓度为1.00 g·L－1的葡萄糖标准溶液。

葡萄糖标准溶液系列:分别移取葡萄糖标准溶液1,2,3,4,5 mL,用水稀释并定容至10 mL,配制成质量浓度为0.10,0.20,0.30,0.40,0.50 g·L－1的葡萄糖标准溶液系列。

鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和半乳糖对照品的纯度均不小于99%;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(TFA)为分析纯;乙腈为色谱纯;试验用水为超纯水。

38批白术样品(S1～S38)来自不同地区,详细信息见表1。

表1 38批白术样品的产地Tab.1 Producing regions of 38 batches of Atractylodes macrocephala samples

1.2 仪器工作条件

SunFire-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温30 ℃;检测波长245 nm;流量1.0 mL·min－1;进样量20μL。流动相A 为0.1 mol·L－1磷酸盐缓冲液(pH 6.0),B 为乙腈;梯度洗脱程序:0～10 min时,A 为83%;10～25 min时,A 由83%降至78%;25～35 min 时,A 由78%降至50%;35～40 min 时,A 由50% 升 至70%;40～45 min时,A 由70%升至83%。

1.3 试验方法

1.3.1 标准指纹图谱的建立

移取单糖混合对照品溶液100μL 置于5 mL的安瓿瓶 中,加 入0.6 mol·L－1氢氧化 钠溶液100μL,混匀,加入0.5 mol·L－1PMP 100μL,于70 ℃反应60 min。取出,放冷,加入0.3 mol·L－1盐酸溶液100μL,转移至5 mL 离心管中,涡旋混匀。加入三氯甲烷1 mL,以转速3 000 r·min－1离心10 min,弃去三氯甲烷层,重复3次至三氯甲烷层无颜色,水层即为混合对照品溶液。按照仪器工作条件测定,使用国家药典委员会发布的«中药色谱指纹图谱相似度评价系统»软件(2004A 版),将混合对照品溶液的HPLC数据进行峰匹配,制作标准色谱图,建立标准指纹图谱。

1.3.2 白术多糖含量的测定

取50 g白术粗粉,用500 mL 水于90 ℃提取2次(第1次3 h,第2次2 h),过滤,将合并的滤液减压浓缩至100 mL,加入250 mL 95%(体积分数,下同)乙醇溶液,静置,过滤,滤渣用无水乙醇反复洗涤,于65℃烘箱中干燥,粉碎,即得白术多糖。白术多糖的质量与白术粗粉质量的比值即为得率。参考文献[13],采用苯酚-硫酸法测定白术多糖的含量。

1.3.3 白术多糖指纹图谱的建立

准确称取0.05 g白术多糖,置于5 mL 安瓿瓶中,用2 mL的4 mol·L－1TFA 溶液溶解,密封,于105 ℃保存6 h。冷却至室温,滤膜过滤,旋蒸,加入3 mL 甲醇,旋蒸干燥(重复3 次),用水定容至10 mL,备用。

对文献[14]中PMP柱前衍生单糖的方法进行了改进。将50μL 的水解多糖样品与50μL 的3 mol·L－1氢氧化钠溶液混合,再加入0.5 mol·L－1的PMP甲醇溶液50μL,于70 ℃反应60 min,放冷,用50μL的0.5 mol·L－1盐酸溶液中和反应混合物。用1 mL 三氯甲烷提取溶液,萃取,静置30 min,重复3次,用水定容至10 mL,过0.45μm滤膜,得到供试品溶液。按照仪器工作条件进行测定,建立白术多糖指纹图谱。

1.3.4 白术多糖抗氧化活性的测定

1) 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力

参考文献[15]方法评价DPPH 自由基清除能力,并计算半数最大抑制浓度(IC50)值。

2) 羟自由基清除能力

参考文献[16],制备羟自由基芬顿反应体系,采用水杨酸比色法测定羟自由基清除能力,并计算IC50值。

3) Fe3＋总还原能力

参考文献[17]方法评价Fe3＋总还原能力,并计算IC50值。

1.3.5 多元统计分析

用角度余弦值评价样品色谱图相对标准色谱图的相似度,使用SIMCA-P(version 11.5,Umetrics AB,Umea,Sweden)软件对白术多糖指纹图谱和抗氧化活性进行相似度分析、层次聚类分析(HCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)等多元统计分析,结果导出至R(版本3.62.0)以进行数据可视化。

2 结果与讨论

2.1 方法学验证

2.1.1 仪器精密度试验

取白术样品S1 按试验方法处理后,按仪器工作条件连续进样5次,记录色谱峰信息。结果显示:以PMP为参考物质,占总峰面积5%以上的主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积没有明显的变化。各主要色谱峰相对保留时间的相对标准偏差(RSD)为0.050%～0.15%,相对峰面积的RSD 为0.58%～2.5%,满足指纹图谱的技术要求(RSD 小于3.0%)。说明仪器精密度良好。

2.1.2 重复性试验

取白术样品S1共5份,按试验方法制备后分别进样分析,并记录色谱峰信息。结果发现:占总峰面积5%以上的主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积没有明显的变化。各主要色谱峰相对保留时间的RSD 为0.080%～2.5%,相对峰 面积的RSD 为0.64%～2.7%,满足指纹图谱的技术要求(RSD 小于3.0%)。说明方法具有良好的重复性。

2.1.3 稳定性试验

称取白术样品S1,按试验方法制备,分别放置0,4,8,12,24 h 后按照仪器工作条件进样分析,记录色谱峰信息。结果发现:占总峰面积5%以上的主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的比值没有明显的变化。各主要色谱峰相对保留时间的RSD 为0.29%～0.59%,相对峰 面积的RSD 为0.88%～2.3%,满足指纹图谱的技术要求(RSD 小于3.0%)。说明样品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

2.2 白术多糖的得率和含量

38批白术样品的多糖得率和含量见表2。其中S19(浙江新昌)多糖得率(32.91%)最高,S14(河北安国)多糖得率(15.04%)最低,其他白术样品中多糖的得率大多为20.00%～30.00%。多糖质量分数最高的是S22(湖南隆回,58.23%),最低的是S26(四川宝兴,23.46%),其他白术样品中的多糖质量分数约为40.00%。结果表明,不同产地白术样品的多糖产量(得率)和含量存在差异,而白术品质可能与多糖产量和含量的差异有关。

表2 38批白术样品中多糖得率和多糖含量Tab.2 Polysaccharide yield and content in 38 batches of Atractylodes macrocephala samples

2.3 指纹图谱分析

在38批白术多糖指纹图谱[图1(a)]中,根据每个指纹峰的相对保留时间(以PMP 的保留时间为参考),多糖的共有峰鉴定出5种单糖,分别为鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖,与标准指纹图谱[图1(b)]对应。

图1 HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints

2.4 相似度分析

采用夹角余弦法对不同产地白术多糖指纹图谱进行相似度分析,结果见表3。结果表明,38批白术多糖的相似度差异明显,为0.47～0.94。在16个产地中,浙江的相似度最高,福建和安徽次之,均大于0.75。此外,产地相近的样品具有相近的相似度。基于结果推测,白术样品的差异与地理位置密切相关。

表3 38批白术多糖的相似度Tab.3 Similarity of 38 batches of Atractylodes macrocephala polysaccharide

表3 (续)

2.5 白术多糖的抗氧化活性

白术多糖的抗氧化活性以IC50值表示。IC50值越低,白术多糖的抗氧化活性越强,结果如图2所示。

图2 38批白术多糖的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of 38 batches of Atractylodes macrocephala polysaccharide

结果表明:浙江、安徽和福建样品的IC50值较小,贵州、湖北和湖南样品的IC50值较大。DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和Fe3＋总还原能力的IC50值的平均值分别为3.833,1.931,2.150 g·L－1。其中,S19(浙江新昌)表现最好,IC50值分别为1.272,0.608,0.930 g·L－1,S35(贵州贵定)表现最差,IC50值分别为8.801,4.326,8.620 g·L－1。相似地理位置样品的抗氧化活性结果相似,即白术的抗氧化活性存在明显的区域差异。多糖含量较高的湖南样品(S22、S23)的IC50值较大,湖北样品(S34)的IC50值也较大,推测白术多糖的抗氧化活性可能与多糖的组成结构密切相关,而与多糖的含量无关,但需要进一步验证。

2.6 层次聚类分析

以组间连接为合并规则,角度余弦值为度量指标,利用HCA 对38批样品进行比较,可将38批样品分为3类,如图3所示。

图3 38批白术多糖的HCAFig.3 HCA of 38 batches of Atractylodes macrocephala polysaccharide

大多数相似地理位置的样品可以相邻聚类,表明多糖组成及其比例与地理分布有一定的关系。河北的部分样品和四川的样品也可以聚为一类,可能与昼夜温差大有关,表明温度可能是影响该组白术生长的主要因素。

2.7 偏最小二乘法-判别分析

16个产地38 批白术样品HPLC 指纹图谱的PLS-DA 模型没有观察到显著差异,因此提取综合指标模型的变量重要性投影值(VIP),寻找对组间差异贡献较大(VIP＞1.0)的成分,如图4所示。

由图4可知:半乳糖醛酸VIP 值为1.22,半乳糖VIP值为1.88,均大于1.0,表明半乳糖醛酸和半乳糖可以作为区分不同来源白术的潜在化学标记物。在3种抗氧化活性检测方法中,DPPH 自由基清除能力指标对应的VIP值为1.03,大于1.0,揭示DPPH 自由基清除能力对应的抗氧化活性可作为白术多糖质量辅助鉴别的候选检测指标。

本工作采用HPLC指纹图谱、抗氧化活性结合化学计量学对16个产地38批白术多糖进行质量评价。基于相似度分析、HCA 和PLS-DA,浙江、安徽、河北和四川的白术样品分离显著。此外,选择半乳糖醛酸和半乳糖作为潜在的化学标记物,DPPH自由基清除能力对应的抗氧化活性可作为辅助鉴别的候选检测指标。本工作表明,指纹图谱和抗氧化活性结合化学计量学是一种可靠的方法,可用于其他生物活性多糖的质量控制,具有实用价值。