胡英婕,王 磊

(锦州医科大学 医疗学院,锦州 121000)

红景天是«中华人民共和国药典»(2020年版)(简称ChP 2020)一部收录的中药材,具有益气活血、通脉平喘功效,用于治疗气虚血淤、胸痹心痛、中风偏瘫、倦怠气喘等症。现代药理学研究表明,红景天还具有抗缺氧、抗疲劳、抗衰老、抗抑郁、抗病毒、提高免疫力的功能。在复方制剂及保健品中都有广泛应用[1-2],约有二十多种红景天为亚洲传统医学的常用药,例如大花红景天、蔷薇红景天、高山红景天等[3-5]。

Ch P 2020中红景天的质量标准中只有单一有效成分红景天苷的含量测定。而红景天的有效成分包括苷类(红景天苷、熊果苷、花色苷)、黄酮类(芦丁、异槲皮苷、槲皮素、山萘酚)、酪醇和没食子酸等,测定红景天中一种或几种有效成分的含量也有报道[6-15],但还没有同时测定红景天中红景天苷、熊果苷、酪醇、没食子酸、山萘酚、槲皮素等6种有效成分含量的报道。本工作采用二极管阵列检测器,提出了高效液相色谱法(HPLC)同时测定红景天中6种有效成分含量的方法,对完善中药材红景天的质量标准、保证药材质量、保证人民群众用药安全有效以及有效开发红景天新制剂提供了参考依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

FΦ2200型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器;KQ-100A 型超声波清洗器;BP211D 型十万分之一电子分析天平。

混合对照品溶液:精密称取红景天苷对照品3.00 mg、熊果苷 对照品2.50 mg、酪醇对照品1.50 mg、没食子酸对照品2.00 mg、山萘酚对照品1.50 mg和槲皮素对照品1.00 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成各对照品质量浓度依次为30.0,25.0,15.0,20.0,15.0,10.0 mg·L－1的混合 对照品溶液。

红景天苷对照品的质量分数为99.4%,批号174458- 201903;熊果苷对照品的质量分数为99.0%,批号165924- 201905;酪醇对照品的质量分数为99.0%,批号135689- 201903;没食子酸对照品的质量分数为99.0%,批号157810- 201901;山萘酚对照品的质量分数为99.0%,批号101149- 201905;槲皮素对照品的质量分数为99.1%,批号142856- 201904;甲醇为色谱纯;磷酸为分析纯;试验用水为二次蒸馏水。

大花红景天、高山红景天、狭叶红景天、长鞭红景天、唐古红景天药材,经某执业药师鉴定为正品药材。

1.2 色谱条件

ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5.0μm);柱温35 ℃;流量0.8 mL·min－1;进样量10μL;流动相A 为甲醇,B 为0.3%(体积分数,下同)磷酸溶液。梯度洗脱程序:0～20 min时,A 为5%;20～30 min时,A 由5%升至15%;30～50 min时,A 由15%升至40%;50～60 min时,A 由40%升至60%;60～75 min时,A 由60%升至80%。检测波长275 nm(0～50 min,检测红景天苷、熊果苷、酪醇、没食子酸),360 nm(50～75 min,检测山萘酚、槲皮素)。

1.3 试验方法

取已过3号筛[孔径为(355±13)μm]的样品粉末约1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入甲醇10 mL,密塞,称重。常温超声提取30 min,放冷,再称重,用甲醇补足减失的质量。摇匀,用0.45μm 滤膜过滤,取续滤液,即得供试品溶液,需根据实际情况稀释至线性范围内,按照色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择

制备供试品溶液时曾用75%(体积分数)乙醇溶液(固液比1.0 g∶30 mL)加热回流提取30 min,得到有效成分的色谱峰峰形不好,且拖尾严重。试验还尝试用70%(体积分数)乙醇溶液(固液比1.0 g∶40 mL)于80 ℃微波提取样品,结果发现红景天苷、熊果苷、山萘酚、槲皮素等4种有效成分的峰面积较小,提取不完全。而用甲醇(固液比1.0 g∶10 mL)常温超声提取样品,得到有效成分的色谱峰峰形较好,分离度高,回收率好。因此,试验最终采用甲醇(固液比1.0 g∶10 mL)常温超声提取样品。

2.2 流动相的选择

试验分别以乙腈-水、乙腈-0.3%磷酸溶液、甲醇-水、甲醇-0.3%磷酸溶液和甲醇-0.5%(体积分数,下同)磷酸溶液为流动相体系进行梯度洗脱。结果表明:以乙腈-水、甲醇-水为流动相体系时,色谱峰拖尾严重;以乙腈-0.3%磷酸溶液、甲醇-0.5%磷酸溶液为流动相体系时,色谱峰峰形不好,分离度差;而以甲醇-0.3%磷酸溶液为流动相体系时,可以避免色谱峰拖尾,峰形及分离效果均较好。因此,试验最终选择以甲醇-0.3%磷酸溶液为流动相体系,梯度洗脱条件见1.2节。

2.3 系统适应性试验

按照色谱条件进样测定,采集275 nm(0～50 min,检测红景天苷、熊果苷、酪醇、没食子酸)、360 nm(50～75 min,检测山萘酚、槲皮素)的色谱图,理论塔板数均不低于3 000,分离度均大于1.5。混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图1。

图1 典型色谱图Fig.1 Typical chromatograms

2.4 标准曲线与检出限

移取适量的混合对照品溶液,用甲醇逐级稀释,配制成红景天苷的质量分别为0.30,0.60,0.90,1.20,1.50,1.80μg,熊果苷 的质量 分别为0.25,0.50,0.75,1.00,1.25,1.50μg,酪醇和山萘酚的质量分别为0.15,0.30,0.45,0.60,0.75,0.90μg,没食子酸的质量 分别为0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20μg,槲皮素 的质量 分别为0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60μg的混合标准溶液系列。按照色谱条件进行测定,以各有效成分的质量为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。所得标准曲线的线性范围、线性回归方程和相关系数见表1。

根据3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(3S/N),结果见表1。

表1 线性参数和检出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.5 精密度试验

按照色谱条件测定混合对照品溶液,平行进样6次。结果表明,红景天苷、熊果苷、酪醇、没食子酸、山萘酚、槲皮素峰面积的相对标准偏差(RSD)分别 为0.91%,0.74%,0.68%,1.1%,0.75%,0.87%,说明仪器的精密度良好。

取同一批次红景天药材,按照试验方法制备供试品溶液,平行测定6次。结果表明,红景天苷、熊果苷、酪醇、没食子酸、山萘酚、槲皮素的测定值依次为8.64,1.44,2.64,2.48,1.74,1.22 mg·g－1,RSD分别为1.1%,0.97%,1.2%,0.73%,0.98%和0.85%,说明方法的重复性良好。

2.6 稳定性试验

取同一批次红景天药材,按照试验方法制备供试品溶液,分别在放置0,4,8,12,24 h后进行测定。结果表明,红景天苷、熊果苷、酪醇、没食子酸、山萘酚、槲皮素峰面积的RSD 分别为0.81%,0.93%,1.2%,0.70%,1.1%,1.1%,说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 回收试验

取样品粉末约0.5 g,精密称定,分别按照红景天苷、熊果苷、酪醇、没食子酸、山萘酚、槲皮素含量的80%、100%、120%加入各对照品,按照色谱条件测定,每个浓度水平测定3次,计算加标回收率,结果见表2。

表2 回收试验结果Tab.2 Results of test for recovery

2.8 样品分析

取5种红景天药材各3批,按照1.3节试验方法制备供试品溶液,并按照1.2节色谱条件进样,测定6种有效成分的含量,结果见表3。对测定结果进行单因素方差分析,结果见表4。

由表3可知,5种红景天药材中所含红景天苷的含量均符合药典规定(最低不少于0.50%)。由表4方差分析结果可知,5种红景天药材中红景天苷、熊果苷、酪醇、山萘酚、槲皮素成分的含量具有显著性差异,样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.01(P＜0.01),没食子酸含量不具有显著性差异,样本间的差异由抽样误差所致的概率大于0.01(P＞0.01)。进一步采用q检验法对样本测定值的平均值进行两两比较,结果显示大花红景天中红景天苷、熊果苷、山萘酚、槲皮素的含量最高,高山红景天中酪醇含量最高,长鞭红景天中红景天苷含量最低,不到大花红景天中红景天苷含量的一半,可能是不同产地生态环境迥异所致。如大花红景天因生长在西藏高海拔地区,自然生长环境严重缺氧和低温干燥,紫外线照射强烈,造成其有效成分含量高。

表3 样品分析结果Tab.3 Analytical results of the samples

表4 红景天中6种有效成分的方差分析结果Tab.4 Results of variance analysis of 6 effective ingredients in Rhodiola

表4 (续)

本工作采用HPLC 同时测定了来自不同产地红景天药材中红景天苷、熊果苷、酪醇、没食子酸、山萘酚、槲皮素的含量,方法操作简便、易行,且方法学验证结果符合要求,可为建立红景天药材的质量标准提供数据支持。由红景天药材样品的测定结果可知,多指标成分含量才能更全面科学地评价该药材质量,其所含化学成分的差异对其药理作用、临床功效产生的影响,有待进一步探索。