杜俊艳 ,刘志荣 ,马 潇 ,李冬华 ,宋平顺 ,张 平 ,张明童∗

(1.甘肃卫生职业学院,兰州 730000;2.甘肃省药品检验研究院,甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室,国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室,兰州 730070)

当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根[1],主产区和道地产区均在甘肃,目前当归药材主要依靠栽培,在青海、云南、四川等高海拔地区均有栽培。研究表明,当归中主要含藁本内酯、阿魏酸、当归多糖、挥发油等活性成分[2-3],具有抗氧化、抗炎、抗心肌缺血、提高免疫、抗肿瘤等作用[4-5]。无机元素在维持人体新陈代谢方面起着关键作用,其进入人体后,一部分与生物大分子结合,以多种金属酶、金属激素、氨基酸及蛋白质的金属络合物等形式调节人体的新陈代谢[6-8],这些无机元素不仅是中药材的组成成分,还可以和药材中其他化学成分形成配合物,对中药中化学结构成分的解析以及有效成分的生物活性表达有着非常重要的作用[9-10]。近年来,以多元统计分析建立的模式识别分析方法在中药评价研究中应用广泛[11-12]。文献[13-15]对某些中药材中的无机元素进行测定,通过多元统计分析,实现了产地的溯源,但鲜有通过无机元素研究不同产地当归的地域性分布及产地溯源的报道。

本工作采用电感耦合等离子体质谱法(ICPMS)测定国内4大产区26批当归药材中Ag、As、Ba、Be、Bi、Cd、Ce、Co、Cr、Cs、Cu、Dy、Er、Eu、Gd、Hg、Ho、In、La、Li、Lu、Mn、Nd、Ni、Pb、Pr、Rb、Sc、Sm、Sr、Tb、Th、Tl、Tm、V、Y 和Yb等37种无机元素的含量,以其实测值为变量,应用主成分分析确定当归中差异性特征元素;再选择特征元素为变量进行层次聚类分析,探索无机元素与药材产地的关系,为当归的产地溯源提供试验方法和理论依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Perkin Elmer 2000型电感耦合等离子体质谱仪;Multiwave 7000 型超级微波消解仪;ME104E型电子天平。

36种元素混合标准储备溶液:移取适量的质量浓度为10 mg·L－1的36种元素混合标准溶液,用3%(体积分数,下同)硝酸溶液稀释,配制成质量浓度为1 000μg·L－1的36 种元素混合标准储备溶液。

Hg 元素标准储备溶液:取质量浓度为1 000 mg·L－1的Hg元素标准溶液,用3%硝酸溶液稀释,配制成质量浓度为1 000μg·L－1的Hg元素标准储备溶液。

混合标准溶液系列:分别移取适量的1 000μg·L－1的36 种元素混合标准储备溶液和1 000μg·L－1Hg元素标准储备溶液,用3%硝酸溶液稀释,配制成36 种元素质量浓度为0,0.01,0.1,0.5,1,10,100,500μg·L－1,Hg元素质量浓度为0,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2μg·L－1的混合标准溶液系列。

混合内标溶液:20μg·L－1,分别移取质量浓度为1 000 mg·L－1的48Ti、103Rh、186Re 内标溶 液2μL,置于100 mL容量瓶中,用3%硝酸溶液稀释至刻度,摇匀。

调谐液:Ce、Co、Mn、Bi、In、Be的质量浓度为0.1 mg·L－1。

36种元素混合标准溶液,10 mg·L－1;Hg元素标准溶液,1 000 mg·L－1;48Ti、103Rh、186Re内标溶液,1 000 mg·L－1;氩气和氦气均为高纯气,纯度为99.999%;硝酸为超高纯;试验用水为超纯水(电阻率大于18.2 MΩ·cm)。

当归药材26批(编号S1～S26),经鉴定均为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根。

采集信息见表1。

表1 不同产地的当归样品信息Tab.1 Information of Angelica sinensis samples from different producing regions

1.2 仪器工作条件

脉冲电压900 V;模拟电压－1 675 V;等离子体功率1.2 k W,流量18 L·min－1;雾化气压力689.5 k Pa;辅助气流量0.80 L·min－1,载气流量0.86 L·min－1;冷却循环水温度15 ℃;测定模式为碰撞反应模式,碰撞气体为氦气,重复测量3次。

1.3 试验方法

分别称取各批次样品粗粉0.3 g,置于石英消解罐中,加入2 mL 硝酸和1 mL 水,混匀,消解程序:0～5 min时,功率升至800 W,保持10 min;15～30 min时,功率由800 W 升至1 200 W,保持20 min;冷却温度80 ℃。待消解完全后,取出,放冷,转移至25 mL容量瓶中,用少量水洗涤消解罐,洗液合并于容量瓶中,用3%硝酸溶液稀释至刻度,摇匀,即得待测溶液。同法制得样品空白溶液。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以各元素的质量浓度为横坐标,对应的响应值为纵坐标绘制标准曲线。所得线性回归方程、线性范围和相关系数见表2。

按照试验方法测定空白样品溶液,平行测定11次,计算空白标准偏差(s),按照3s/k(k为标准曲线的斜率)计算检出限,按照10s/k计算测定下限,结果见表2。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

结果表明,各元素的质量浓度与对应的响应值在一定范围内呈线性关系,相关系数均大于0.990 0;各元素的检出限为0.02～48.43μg·kg－1,测定下限为0.06～161.44μg·kg－1。

2.2 重复性和稳定性试验

取样品6份,分别按1.3节试验方法制备待测溶液,按1.2节仪器工作条件进行测定,计算各元素测定值的相对标准偏差(RSD)。结果表明,各元素测定值的RSD 为0.81%～3.6%,说明方法重现性良好。

取上述待测溶液1份,分别放置0,2,4,8,12 h后测定,结果显示,各元素测定值的RSD 为0.83%～2.1%,说明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3 精密度和回收试验

取已知含量的供试品进行加标回收试验,每个浓度水平按照试验方法平行测定5次,计算各元素的回收率及测定值的RSD,结果见表3。

由表3可知,37种元素的回收率为78.9%～116%,RSD 为0.81%～4.8%,说明方法的准确度和精密度良好。

表3 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

2.4 样品分析

在甘肃、青海、四川和云南等地采集了26批当归药材,按照试验方法测定其中37种无机元素的含量,结果见图1,其中Tm、Lu、Bi、In、Ag未检出,未列入图1。

图1 样品分析结果Fig.1 Analytical results of the samples

结果表明:当归药材中含有的主要无机元素为Ba(9.2～15.1 mg·kg－1)、Rb(8.6～16.3 mg·kg－1)、Mn(28.1～45.3 mg·kg－1)、Sr(19.1～29.5 mg·kg－1)、Cr(4.1～18.2 mg·kg－1)、Cu(6.7～9.4 mg·kg－1),以中位数统计各元素含量由大至小依次排序为Mn、Sr、Rb、Ba、Cr、Cu、V、Ce、Li、Ni、La、Nd、Y、Pb、Co、As、Sc、Th、Cs、Pr、Gd、Sm、Dy、Er、Yb、Cd、Hg、Tl、Be、Eu、Tb、Ho,这反映了在特定的生长环境下当归对无机元素的吸收特征,当归对无机元素的吸收受自身对不同无机元素的吸收能力和根际土壤环境的影响。其中重金属及有害元 素Pb(0.2～0.9 mg·kg－1)、Cd(0.02～0.06 mg·kg－1)、As(0.2～1.2 mg·kg－1)、Hg(0.002～0.03 mg·kg－1)、Cu(6.7～9.4 mg·kg－1)的含量均在WM/T 2－2004«药用植物及制剂外经贸绿色行业标准»中各元素限量值(Hg、As、Pb、Cu、Cd的限量值分别为0.2,2.0,5.0,20.0,0.3 mg·kg－1)以下。

2.5 当归中无机元素的含量等级

由于环境因素和植物自身的遗传变异造成的遗传特征不同,同种植物对不同无机元素的累积量不同,会有常量元素、微量元素及痕量元素的区别。而且不同的无机元素的本底差异极大,同种植物中不同无机元素含量的差异比较难以得出有意义的结论。只有比较同一种无机元素在某一植物中的含量和在自然界植物中的总体含量,才能更好地判断该植物中无机元素含量在总体水平上究竟处于哪种水平。试验利用植物类中药中无机元素含量区间表来度量当归中各元素含量的相对水平,将自然界植物中无机元素划分为1～10级,等级越高表明该植物中某种元素在自然界的相对水平越高[16]。从测定结果来看,当归药材中V(6级)和Co(6级)与其他植物相比处于中等水平;Ni(4 级)、Sr(4 级)、Mn(3级)、Ba(3级)、Be(2级)与其他植物相比处于较低水平,不同产地当归药材中无机元素含量等级略有差别,但多数产地的当归药材中各无机元素含量等级顺序较为稳定。另外当归药材中重金属及有害元素Hg(4级)、Cu(3级)、Cd(2级)、As(3级)均处于较低水平,说明当归根际对这4种重金属及有害元素富集能力较其他植物弱。

2.6 不同产地当归中无机元素的主成分分析

试验共测定当归中37种无机元素的含量,其中32种元素为有效数据,采用SPSS 24.0软件对测得的样本数据进行主成分分析,以期寻找表达产地差异的主要特征元素。测得样本数据经Bartlett检验,结果显示29种无机元素含量数据呈正态分布,其主成分分析结果见表4。

由表4 可知,总方差的84.051%贡献来自前4个主成分,即这4个主成分包含了84.051%的当归中所测定的32种元素的信息数据。

表4 当归中无机元素的主成分分析特征值和方差贡献率Tab.4 Characteristic values and variance contribution rates of principal component analysis of inorganic elements in Angelica sinensis

经旋转的成分矩阵分析可以确定4个主成分主要包含哪些元素的信息,分析结果见表5。

由表5可知,主成分1 中Sm、Nd具有较高的载荷值,主成分2中Cu、Cr具有较高的载荷值,主成分3中Cd、Rb具有较高的载荷值,主成分4 中Rb、Sr具有较高的载荷值。根据主成分对总方差的贡献率,结合因子载荷,可以认为Sm、Nd、Cu、Cr、Cd、Rb和Sr是当归的7种特征无机元素。

表5 方差最大正交法设计旋转后的主成分载荷矩阵Tab.5 Principle component matrix rotated by variance maximum orthogonal design

2.7 不同产地当归的层次聚类分析

试验以所测26批样品的7种特征无机元素含量数值为变量,采用SPSS 24.0统计分析软件对样品进行层次聚类分析,结果见图2。

由图2可知,26批当归样品聚为2类,大致可聚类为西北产区和西南产区。其中Ⅰ类包括8批当归样品(S19～S26),采自四川(S19～S22)和云南(S23～S26),四川和云南均地处西南,所产当归中7种特征无机元素分布更为相似;Ⅱ类包括18批当归样品(S1～S18),明显聚类为甘肃岷县(1类)和青海(2类)2个小类,说明甘肃岷县所产当归中7种特征无机元素分布与青海所产当归有一定差异。分析表明,不同产地当归中无机元素的分布呈明显的地域特性,通过当归中元素的差异分析可以实现当归的产地判别和溯源。另外现代研究表明,无机元素不仅参与人体代谢调节,还可以与中药中其他化学成分形成配合物以表达中药生物活性[6-8]。因此,以当归中无机元素为切入点研究其地理差异性以及生物活性的表达,将为当归的多指标评价体系、产地溯源提供一定的研究思路。

图2 不同产地当归中无机元素的层次聚类分析树状图Fig.2 Hierarchical cluster analysis dendrogram of inorganic elements in Angelica sinensis from different producing regions

本工作以硝酸溶液消解采自甘肃、青海、四川和云南共计26批次的当归样品,采用ICP-MS测定其中37种无机元素的含量,该方法操作简便、快速、准确度高,可为当归中无机元素的测定提供依据。另外,应用主成分分析和层次聚类分析方法确定当归中差异性特征元素,将样品按产区进行了区分,反映了样本的地域性,可为当归产地的选择和种植栽培提供参考。