王成 马景鑑 (天津市津南医院脑系科，天津 300350；天津市第一中心医院神经外科)

缺血性脑卒中占所有脑卒中的80%以上，且以致残率高及致死率高为特点，严重威胁着人类的健康和生活质量，其中近75%的脑卒中患者为年龄大于65岁的老年人，因为缺乏有效的治疗策略，直到现在缺血性脑卒中的治疗仍然是一项艰巨的任务〔1，2〕。缺血性脑卒中介入或溶栓治疗血管再通后，由脑缺血再灌注损伤(CIR)所致的继发神经损伤在临床治疗中十分常见，这些事件包括炎症、血脑屏障(BBB)破裂、脑水肿、坏死及凋亡〔3，4〕。二甲双胍是一种双胍，广泛用于2型糖尿病与代谢综合征的治疗，研究表明二甲双胍具有多种药理活性，比如抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗肿瘤，且能够通过BBB，在多领域具有重要的应用价值〔5，6〕。本研究旨在探讨二甲双胍对老年CIR大鼠脑水肿的影响及机制，验证其对CIR老年大鼠的神经功能保护作用，为老年患者CIR的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1动物及材料 SPF级健康老年SD大鼠(天津实验动物中心提供)60只，18～20月龄，雌雄不限，体重490～680 g，动物批号：SYXK(津)2019-0004。二甲双胍(Sigma，USA，货号D150959-5G)；基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、水通道蛋白(AQP)9、β-actin单克隆抗体(sigma公司，美国)、Trizol试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、Western印迹试剂盒(碧云天生物技术研究所)；引物合成(上海生工)；普通光学倒置显微镜(Nikon)；过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；激光多普勒血流测定探头(瑞典perimed)。

1.2方法

1.2.1大鼠CIR模型制作及分组 60只SD老年大鼠，室温25℃左右饲养，术前12 h禁食，自由饮水，随机分为3组：假手术组(n=20)、缺血/再灌注(I/R)组(n=20)、二甲双胍组(n=20)。CIR模型制作按参考文献进行〔7〕，假手术组只进行手术操作，但不插入线栓阻断大脑中动脉血流；I/R组：通过直径 0.28～0.32 mm的线栓阻断大鼠大脑中动脉血流，造成大鼠局灶性脑缺血，缺血2 h后拔出线栓恢复血流再灌注，给予等量的0.9%生理盐水腹腔注射；二甲双胍组：大鼠CIR制模成功后，予二甲双胍(50 mg/kg)腹腔注射，1次/d，连续7 d。造模或治疗过程中有大鼠死亡或脱失重新造模后补上。

1.2.2脑血流量的测定及神经功能缺损评分 治疗7 d，各组随机选5只大鼠(不处死，可进行后继检测)，将激光多普勒血流测定探头通过泰乐胶固定在顶部百会穴(两耳尖连线中点)，测定老年大鼠局灶性脑缺血区血流量，因Perimed 激光多普勒血流测定仪的显示结果为电压值，该电压值与脑血流量呈正比，故本实验直接将电压值行统计学分析，作为老年大鼠脑血流量相对值，待仪表稳定1 min后对数值进行记录，参考文献〔8〕行神经功能缺损评分，操作过程由专业人员统一完成。

1.2.3脑组织含水百分比测定 治疗7 d，各组随机选5只大鼠，断头法处死后取脑组织置于称过重的铝箔上测定重量，脑组织湿重为测得重量与铝箔重量的差值，将外包铝箔的脑组织置于恒温烤箱内(温度90℃，时间24 h)烘干，烘干后取出，待其自然降温到室温后再次进行测重，测得重量与铝箔重量的差值为脑组织干重，脑组织含水百分比=(1-脑干重/脑湿重)×100%。

1.2.4脑组织苏木素-伊红(HE)染色 治疗7 d，各组随机选5只大鼠，4%的多聚甲醛经心灌流固定后，迅速断头取脑，将脑组织石蜡包埋后，矢状连续切片，片厚5 μm，石蜡切片按常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇脱水，二甲苯透明处理后，苏木素染色3 min，自来水冲洗，盐酸乙醇分化10 s后伊红染色3 min，自来水冲洗，中性树脂封固后，光镜观察脑组织病理学变化。

1.2.5脑组织NO、SOD、MDA、CAT、GSH-Px检测 治疗7 d，各组随机选5只大鼠，断头法处死后取脑组织，称重后按(1∶9)加入4℃的生理盐水后制备脑组织匀浆，于3 000 r/min离心15 min，取上清液，-20℃保存。按相关试剂盒说明操作步骤测定脑组织中SOD、CAT、GSH-Px活性及NO、MDA水平。

1.2.6RT-PCR 检测MMP-2、MMP-9、AQP9基因表达 治疗7 d，各组剩余5只大鼠，断头法处死后取脑组织，取50 mg脑组织，按Trizol说明书行总RNA提取，按逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA，然后再将cDNA行PCR扩增。MMP-2 引物：上游：5′-TTTTTGTGCCCAAAGAAAGG-3′，下游：5′-ATGTCAGACAACCCGAGTCC-3′，产物长度为414 bp；MMP-9引物：上游：5′-CCAGCTGTGATTCCAAAACGGAC-3′，下游：5′-TGCAAGGATTGTCATCTGGA-3′，产物长度为379 bp；AQP9 引物：上游：5′-CCAGCTGTGATTCCAAAACGGAC-3′，下游：5′-TCTAGTCATACTGAAGACAATACCTC-3′，产物长度为305 bp；β-actin 引物：上游：5′-CCATCATGAAGTGTGACGTTG-3′，下游：5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA-3′，产物长度为175 bp，反应条件如下：95℃预变性1 min，95℃变性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，将扩增产物电泳，通过凝胶图像处理系统分析光密度，计算MMP-2、MMP-9、AQP9与β-actin的光密度比值，作为MMP-2、MMP-9、AQP9表达指标。

1.2.7Western印迹检测MMP-2、MMP-9、AQP9蛋白表达 将RT-PCR提取剩余物以 1 500 r/min离心30 min，取上清粗体蛋白，用BCA法行蛋白定量，-80℃冰箱保存。50 μg样品蛋白，配置12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶，蛋白上样后电泳分离，90 V转膜60 min，恒流湿转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，将目的条带切下后，通过磷酸盐缓冲液(PBS)配制的5% BSA封闭2 h，然后加入相应MMP-2、MMP-9、AQP9与β-actin兔抗鼠一抗(1∶1 500)4℃孵育过夜；PBS洗膜后，加入二抗HRP标记的羊抗兔IgG(稀释度为1∶5 000)37℃孵育2 h，PBS洗膜，电化学发光(ECL)显色，曝光后扫描，Image Pro-plus软件 行灰度值统计分析，算MMP-2、MMP-9、AQP9与GAPDH的灰度比值，作为MMP-2、MMP-9、AQP9 蛋白的表达指标。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计分析，数据经K-S检验符合正态分布，多组间的比较予以方差分析，组间比较应用LSD-t检验。

2 结 果

2.1脑血流量及脑组织含水百分比 与假手术组相比，I/R组脑组织含水百分数显著升高，脑血流量显著降低(P<0.05)，神经功能缺损评分显著升高(P<0.05)；二甲双胍组较I/R组脑组织含水百分数显著降低，脑血流量显著升高(P<0.05)，神经功能缺损评分显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组脑血流量、脑组织含水百分比及 神经功能评分比较

2.2各组脑组织病理变化 假手术组脑组织细胞层次分明，胞核圆形，未见脑水肿。I/R组神经细胞肿胀松散，脑水肿明显，层次紊乱，结构欠清。二甲双胍组神经细胞肿胀松散程度及脑水肿程度较I/R组减轻，见图1。

2.3各组脑组织 NO、MDA水平及SOD、CAT、GSH-Px活性比较 与假手术组比较，I/R组脑组织NO、MDA含量显著升高(P<0.05)，脑组织SOD、CAT、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；与I/R组相比，二甲双胍组NO、MDA含量显著降低(P<0.05)，脑组织SOD、CAT、GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。见表2。

图1 各组I/R脑组织病理变化(HE染色，×100)

表2 各组脑匀浆中NO、SOD、MDA、CAT、GSH-Px水平比较

2.4MMP-2、MMP-9、AQP9 mRNA表达水平 与假手术组相比，I/R组脑组织MMP-2、MMP-9、AQP9 mRNA表达明显升高(P<0.05)，二甲双胍组脑组织MMP-2、MMP-9、AQP9 mRNA表达较I/R组显著降低(P<0.05)，见图2，表3。

图2 各组MMP-2、MMP-9、AQP9 mRNA表达

表3 各组脑组织MMP-2、MMP-9、AQP9 mRNA 表达

2.5MMP-2、MMP-9、AQP9 蛋白表达水平 与假手术组相比，I/R组脑组织MMP-2、MMP-9、AQP9蛋白表达明显升高(P<0.05)，二甲双胍组脑组织MMP-2、MMP-9、AQP9蛋白表达较I/R组降低，差异显著(P<0.05)，见表4，图3。

表4 各组脑组织MMP-2、MMP-9、 AQP9 蛋白 表达

3 讨 论

目前传统的治疗方法仍未能有效实现I/R后神经细胞的再生及神经功能的有效修复〔9〕。二甲双胍对多种中枢神经系统疾病的动物模型有神经保护作用，通过调节炎症反应、神经元凋亡、氧化应激等对脊髓损伤或CIR动物模型发挥神经保护作用〔10～13〕。

本研究组织学方面发现二甲双胍减轻了CIR老年大鼠脑水肿病理变化，对CIR老年大鼠脑组织损伤有改善作用，有效提高CIR老年大鼠脑组织血流量，改善脑组织血供，减轻大鼠脑组织水肿，使得脑组织含水百分比降低，发挥脑保护作用。

本研究结果表明氧化应激反应是导致CIR老年大鼠脑损伤和脑水肿的重要因素，二甲双胍干预能够降低CIR老年大鼠脑组织的自由基，提高脑组织的抗氧化作用，进而减轻了CIR老年大鼠脑水肿，发挥对脑组织的保护作用。MMP-2、MMP-9及AQP9的高表达是脑组织水肿及继发损伤过程中的重要因素，本研究结果表明二甲双胍治疗通过调控MMP-2、MMP-9、AQP9基因蛋白表达减轻组织水肿发挥脑保护作用。

综上，二甲双胍治疗可明显减轻CIR老年大鼠脑损伤和脑水肿，提高I/R脑组织局部的血流量，降低神经功能缺损评分，为二甲双胍在老年缺血性脑卒中的应用提供了理论依据。