林芷萱，杨小霖

(川北医学院，1.麻醉学系；2.第二附属医院麻醉科，四川 南充 637000)

目前，气相色谱仪常用于测定气相和液相中的挥发性吸入麻醉药浓度。气相色谱法(gas chromatography，GC)具有效能高、相对灵敏、选择性强、快速、稳定、重复性好等特点。七氟烷因具有诱导快、对呼吸和循环影响小、苏醒迅速等优点广泛应用于临床。七氟烷进入体内后绝大部分以原型经呼吸道排出，仅约5%在肝脏内代谢[1]，在细胞色素P450酶系作用下转化生成无机氟离子及六氟异丙醇(hexafluoro-isopropanol，HFIP)[2-4]。国外研究[5]报道，吸入七氟烷麻醉后所生成的游离HFIP浓度不足血中七氟烷浓度的1%。有研究[6]表明，HFIP在SD大鼠的最低肺泡有效浓度极低(0.004 4%)，说明HFIP具有很强的潜在麻醉作用，且可能协同影响七氟烷的麻醉强度。由于HFIP的血/气分配系数极大，体内排出缓慢，可能导致患者苏醒延迟或苏醒期躁动的发生。但大鼠吸入一定浓度的七氟烷麻醉后血中游离HFIP的生成规律尚不清楚。本小组前期研究[7-8]中发现，由于HFIP具有极大的血/气分配系数(B/G)，若常规使用顶空二次平衡法测定其浓度，则在第二次平衡完成时，要从气相中测出HFIP的浓度则极为困难且偏差较大。本研究旨在探讨联合应用一次平衡法和二次平衡法准确测定大鼠吸入七氟烷麻醉后血中HFIP含量的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验药品及仪器

液态七氟烷：120 mL/瓶(上海恒瑞医药有限公司)；液态HFIP：10 mL/瓶(美国Sigma Aldrich公司)；肝素钠注射液：2 mL∶12 500单位/支(马鞍山丰原制药有限公司)；0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)。Agilent Technologies气相色谱仪(GC7890A)；Ugo动物麻醉机(Ugo Basile，意大利)；七氟烷专用蒸发器(Vaor2000，德国)；SPH-300A氢气发生器(北京中惠普)等。气相色谱仪测定条件：色谱柱(Agilent19091J-413)：325 ℃，30.00 m×320.00 μM×0.25 μM，柱箱温度45 ℃，氢离子火焰检测器温度200 ℃，后进样口温度100 ℃，氢气流速30 mL/min，空气流速400 mL/min，氮气流速20 mL/min。

1.2 方法

1.2.1 待测气体标准曲线的制备 在上述气相色谱测定条件下，采用倍比稀释法利用已知浓度的七氟烷(或HFIP) 标准气制备色谱峰面积-麻醉药物浓度的标准曲线[9]，并得出相应的线性回归方程(y=mx+b)及相关系数(r)，其中x为麻醉药浓度(%)，y为峰面积，相关系数r应达到>0.999。需要注意的是，当日待测气体浓度范围要包含在该标准曲线建立的范围之内，即建立的标准曲线方程中x的范围应覆盖所有待测气体浓度。

1.2.2 实验大鼠的麻醉处理 将室温控制在25 ℃，从预定的42只健康成年SD大鼠中随机选取6只，采用水合氯醛腹腔注射麻醉后，随即腹主动脉取血5～7 mL转移至带有三通的气密性良好的注射器内，用于测量SD大鼠标准品HFIP的血/气分配系数[10]。余下36只大鼠，用随机数字表法分成6组，每组各6只，分别接受1 MAC(2.32%)浓度的七氟烷麻醉[11]，麻醉时间分别为0.5 h(S1组)、1.0 h(S2组)、1.5 h(S3组)、2.0 h(S4组)、3.0 h(S5组)和4.0 h(S6组)。麻醉开始时将麻醉装置氧流量调至2 L/min，利用气相色谱仪校正七氟烷挥发罐浓度，确保挥发罐实际输出的七氟烷浓度接近设定值。随后向自制大鼠麻醉装置预充七氟烷(时间≥5 min)，将其中一组大鼠放入麻醉框中开始计时。当吸入麻醉达设定时间后，在尽可能使得大鼠不脱离原七氟烷麻醉环境条件下，迅速开腹从腹主动脉取血5～7 mL，转移至带有三通的密闭注射器，置于恒温箱内，进行平衡处理。其余各组均按上述要求完成麻醉并取样。

1.2.3 样本中七氟烷及HFIP浓度测定 首先应用注射器顶空二次平衡法完成HFIP样品血/气分配系数的测定[9，12-14]。用上述装有未经七氟烷麻醉的大鼠血液样本的6支注射器分别吸取6 mL当日所配制的较高浓度的HFIP标准气，吸空气至18 mL刻度处并关闭三通，放入37 ℃恒温箱内进行空气浴。每15 min取出震荡20次，然后重新置于恒温箱内，如此反复至1.5 h时，取出注射器，抽吸空气至20 mL刻度处后继续于恒温箱中进行重新平衡1.0 h，总平衡时间为2.5 h。此时HFIP在液相及气相中达第一次平衡，采用顶空法用气相色谱仪测出此时注射器内气相中HFIP的浓度，记为C1。排出注射器内全部气体及部分液体，使注射器内剩余3 mL液体，随即抽吸空气至18 mL刻度处，关闭三通继续上述平衡，步骤同第一次平衡。2.5 h后HFIP在气、液相中达第二次平衡。用气相色谱仪测定此时气相中HFIP浓度，记为C2。由于第二次平衡结束后两相中麻醉药总量等于第二次平衡开始时的药物量，得出以下公式：

C2×V2+CL2×VL2=CL1×VL2

(1)

其中C2为第二次平衡结束后用气相色谱仪测得的气相中吸入麻醉药浓度(vol %，气态容积百分比浓度)；V2和VL2分别为第二次平衡时注射器内气体和剩余液体的容积(mL)，CL1和CL2分别为第一次和第二次平衡结束时注射器内液相中吸入麻醉药浓度(vol%)。液/气分配系数为达到平衡时液相中麻醉药浓度与气相中麻醉药浓度的比值：

λ=CL1/C1或者λ=CL2/C2

(2)

公式中C1为第一次平衡结束时测得的气相中HFIP浓度(vol%)。将公式(1)、(2)换算可推出：

λ=(V2/VL2)×C2/(C1-C2)

(3)

此公式即为二次平衡法测定HFIP血/气分配系数λ的计算公式。

一次平衡法测定血中HFIP浓度：取上述装有麻醉后血液样本的注射器，抽空气使注射器内总体积达18 mL，关闭三通，将其放入37 ℃的恒温箱内进行一次平衡，步骤同上。2.5 h后测得此时注射器内气相中HFIP的浓度，记为C1。根据第一次平衡结束时两相中麻醉药总量守恒，可得出以下公式：

V0×C0= VG1×C1+V0×CL1

(4)

将公式(2)和公式(4)进行转换，可推出待测液体中实际挥发性麻醉药浓度：

C0= C1×(VG1/V0+λ)

(5)

其中V0表示被测液体的体积(mL)；C0表示被测液体中挥发性麻醉药的浓度(vol%)；VG1、C1分别表示平衡结束时注射器内气体的体积和气相中麻醉药浓度；CL1表示平衡结束时液相中麻醉药浓度(vol %)。λ引用前面测得的HFIP在SD大鼠体内的血/气分配系数进行计算。

二次平衡法测定血中七氟烷浓度：操作步骤与测定HFIP的血/气分配系数时相同。当达到一次平衡时，注射器内七氟烷总量等于平衡最初待测血液中所含七氟烷的量，因此有：

VG1×C1+V0×CL1=V0×C0

(6)

结合公式(2)、(6)可得出待测血液中七氟烷浓度C0的计算公式为：

C0=VG1×C1/V0+C1×λ

(7)

由以上公式(3)、(7)即能得出待测样本血液中七氟烷血/气分配系数及其浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

本实验测得37 ℃条件下，SD大鼠HFIP的血/气分配系数为453.18±74.20。吸入1 MAC浓度七氟烷麻醉不同时间后各组大鼠血中均能测出游离HFIP及七氟烷。血中游离HFIP浓度随着吸入麻醉时间延长其浓度呈先增高后降低趋势，其峰值出现在吸入七氟烷麻醉后1.0 h。血中七氟烷浓度随着吸入时间的延长逐渐增加，2.0 h后趋于平稳。见表1及图1。

表1 各时点血中游离HFIP及七氟烷浓度

3 讨论

气相色谱法现已广泛应用于测定挥发性吸入麻醉药在气相和液相中的浓度。顶空法(Headspace)通过气相色谱仪可测定液相中挥发性麻醉药的液/气分配系数(λ)，从而进一步得出液相中麻醉药浓度[12]。液相中挥发性麻醉药浓度的测定可使用一次平衡法和二次平衡法。一次平衡法需引用参考文献中已有的分配系数进性计算。二次平衡法则可同时测出该种药物的液/气分配系数λ和浓度，减少了实验的个体误差，提高了测定结果的准确性，但二次平衡法较一次平衡法耗时更长[10，12-14]。

七氟烷吸入麻醉后，在体内通过肝脏代谢生成的HFIP含量很低，且大部分与葡萄糖醛酸结合生成结合型HFIP，并通过肾脏排出，仅约15%的HFIP以游离型存在于血液中。由于HFIP本身具有麻醉作用，可能影响七氟烷的麻醉效应[2，15]。本小组前期临床试验在37 ℃条件下测得人体HFIP的血/气分配系数为452.25[16]，与本试验测得的SD大鼠HFIP的血/气分配系数极为相似(453.18)，可见动物及人体HFIP的血/气分配系数均很大。血/气分配系数是指在一定大气压和一定温度条件下，吸入麻醉药在液、气两相间运动达到平衡时的浓度比值。血/气分配系数越大说明该药物越容易溶解于血液中，在两相中达到平衡所需时间越长，诱导和苏醒越缓慢。因七氟烷麻醉生成的游离HFIP含量较低(<1%)，加之HFIP血/气分配系数大，可推知血液样本在注射器内进行平衡时气相中HFIP浓度很低，如果使用二次平衡法，在第二次平衡时血中含量极低的游离HFIP便不容易挥发出来，将对测定结果的准确性产生一定影响。因此，本实验将一次平衡法及二次平衡法联合应用，先利用已知高浓度的标准品HFIP气体通过二次平衡法测得SD大鼠HFIP的血/气分配系数，再使用一次平衡法并引用已测得的HFIP血/气分配系数，从而推算出七氟烷麻醉后血中所生成的游离HFIP浓度，以减少实验误差。同时，由于七氟烷血/气分配系数较小，平衡时易从液相中挥发出来，故可直接采用二次平衡法同时测得其分配系数及血中七氟烷浓度，而无需引用文献中血/气分配系数数据。本研究结果显示，七氟烷麻醉后0.5 h，即能在血中监测出游离HFIP，说明HFIP在体内生成迅速，与Kharasch[1]报道相符。随着吸入麻醉时间的延长，血中所生成的游离HFIP浓度增加，在吸入麻醉1.0 h后达峰值，随后逐渐下降。Eger等[6]研究表明，SD大鼠HFIP的MAC值为0.004 4%。由于HFIP的血/气分配系数很大，在体内半衰期长(20.1±8.2 h)[15]，排出缓慢，由此可以推测七氟烷麻醉一定时间后，代谢所生成的游离HFIP可在体内蓄积，并产生麻醉作用，由此可能影响七氟烷的MAC值。同时，本研究小组推知，临床上七氟烷麻醉后较高的苏醒期躁动发生率[17]可能与其代谢产物HFIP的影响有关。

本实验将一次平衡法及二次平衡法结合起来，用于测定七氟烷麻醉后血中生成的游离HFIP浓度，解决了单独使用二次平衡法在第二次平衡时无法测出血中极低HFIP含量的问题，为动物实验及临床试验中测定HFIP含量提供了方法性参考，为七氟烷的代谢研究奠定了方法学基础。该方法适用于样本中药物含量低，且血/气分配系数较大的挥发性麻醉药的浓度测定。